CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) เป็นเทคนิคการแก้ไขจีโนมรุ่นที่สามที่ปฏิวัติวงการด้วยผลลัพธ์ที่มีประสิทธิภาพสูง มีการนำไปใช้ในการรักษาโรคทางชีวภาพและการติดเชื้อต่างๆ แบคทีเรียและจุลินทรีย์โปรคาริโอตอื่นๆ (เช่น อาร์เคีย) ก็มีระบบ CRISPR/Cas9 เพื่อป้องกันตัวเองจากไวรัสฟาจ มีรายงานว่ากลยุทธ์ที่ใช้ CRISPR/Cas9 สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตและการลุกลามของมะเร็งเต้านมชนิดสามลบ (TNBC) โดยการกำหนดเป้าหมายไปที่ยีนต้านทานยาที่อาจเปลี่ยนแปลงไป การถอดรหัส และการควบคุมทางเอพิเจเนติกส์ การรักษาเหล่านี้อาจช่วยแก้ปัญหาที่ท้าทาย เช่น การดื้อยาที่พบได้แม้ใน TNBC ปัจจุบันมีการใช้วิธีการต่างๆ ในการส่ง CRISPR/Cas9 ไปยังเซลล์เป้าหมาย เช่น วิธีทางกายภาพ (การฉีดไมโคร การใช้กระแสไฟฟ้า และวิธีไฮโดรไดนามิก) วิธีทางไวรัส (ไวรัสอะเดโนแอสโซซิเอตและไวรัสเลนติ) และวิธีที่ไม่ใช้ไวรัส (ไลโปโซมและอนุภาคไขมันนาโน) แม้ว่าจะมีการพัฒนารูปแบบจำลองต่างๆ เพื่อศึกษาถึงสาเหตุระดับโมเลกุลของมะเร็งเต้านมชนิด TNBC แต่การขาดวิธีการที่มีความไวและตรงเป้าหมายในการส่งเครื่องมือแก้ไขจีโนมเข้าสู่ร่างกายโดยตรง ทำให้การนำไปใช้ในทางคลินิกมีข้อจำกัด โดยสรุปแล้ว บทความนี้ได้ตรวจสอบความก้าวหน้า ความท้าทาย ข้อจำกัด และแนวโน้มของการรักษาด้วย CRISPR/Cas9 สำหรับมะเร็งเต้านมชนิด TNBC อย่างครอบคลุม โดยอิงจากหลักฐานที่มีอยู่ นอกจากนี้ เรายังเน้นให้เห็นว่าการผสมผสานระหว่างปัญญาประดิษฐ์และการเรียนรู้ของเครื่องจักรสามารถช่วยปรับปรุงกลยุทธ์ CRISPR/Cas9 ในการรักษามะเร็งเต้านมชนิด TNBC ได้อย่างไร
มะเร็งมีลักษณะเฉพาะคือการแบ่งเซลล์ที่ไม่สามารถควบคุมได้ การหยุดชะงักของจุดตรวจสอบวงจรเซลล์ และการกลายพันธุ์ในยีนยับยั้งเนื้องอก (TSGs) (Matthews et al., 2022) ในบรรดามะเร็งชนิดต่างๆ มะเร็งเต้านมเป็นมะเร็งที่พบได้บ่อยที่สุดในผู้หญิงและมีอัตราการเสียชีวิตสูงทั่วโลก (Waks and Winer, 2019) มะเร็งเต้านมเป็นโรคที่มีความหลากหลาย มีลักษณะเฉพาะที่แตกต่างกัน เช่น ลักษณะทางเนื้อเยื่อวิทยาและชีววิทยา อาการทางคลินิกและพฤติกรรม และการตอบสนองต่อการรักษา (Weigelt et al., 2010) การจำแนกประเภทมะเร็งเต้านมให้ข้อมูลเชิงลึกที่แม่นยำสำหรับการวินิจฉัยมะเร็งเต้านมและการพยากรณ์โรค การใช้ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพทั่วไปและลักษณะทางคลินิกและพยาธิวิทยาเป็นเกณฑ์หลักสำหรับการจำแนกประเภทมะเร็งเต้านม (Tsang and Tse, 2019) การพยากรณ์โรคและการตอบสนองต่อการรักษาของมะเร็งเต้านมได้รับอิทธิพลจากหลายปัจจัย รวมถึงการมีอยู่ของตัวรับเอสโตรเจน (ER), ตัวรับโปรเจสเตอโรน (PR), ตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังมนุษย์ 2 (HER2/neu) และระดับความรุนแรงทางเนื้อเยื่อวิทยา ชนิดและขนาดของเนื้องอก และการแพร่กระจายไปยังต่อมน้ำเหลือง (Al-Tubaiti, 2020) มีการระบุชนิดย่อยทางโมเลกุลภายในของมะเร็งเต้านมไว้ 5 ชนิด ได้แก่ ลูมินัล A, ลูมินัล B, HER2-enriched, basal-like และ claudin-low (Prat et al., 2015) TNBC เป็นชนิดย่อยทางโมเลกุลของมะเร็งที่ไม่แสดงออกถึง ER, PR และ HER2 ทั้งหมด (Yin et al., 2020) ลักษณะทางพยาธิวิทยาเหล่านี้เกี่ยวข้องกับ TNBC ซึ่งยืนยันถึงการลุกลามอย่างรวดเร็วและลักษณะที่รุนแรงกว่ามะเร็งเต้านมชนิดอื่น ๆ (Feng et al., 2018) นอกจากนี้ Peru et al (2000) ยังใช้เทคโนโลยีไมโครอาร์เรย์ในการจัดประเภทมะเร็งเต้านมใหม่และระบุชนิดย่อยภายในของมะเร็งเต้านมได้ 5 ชนิด (Cadenas, 2012) มะเร็งเต้านมชนิดเบซัลไลค์ (Basal-like breast cancer) เป็นชนิดย่อยของมะเร็งเต้านมที่มีลักษณะฟีโนไทป์แบบทริปเปิลเนกาทีฟ (Triple-negative phenotype) และเกี่ยวข้องกับการลุกลามอย่างรวดเร็ว ควรสังเกตว่ามะเร็งเต้านมชนิดเบซัลไลค์ทั้งหมดมักได้รับการวินิจฉัยผิดว่าเป็น TNBC (Triple Negative Breast Cancer) แต่มีเพียง 77% เท่านั้นที่เป็น TNBC ในทางตรงกันข้าม 71–91% ของ TNBC เป็นชนิดเบซัลไลค์ ซึ่งบ่งชี้ว่ามะเร็งเต้านมทั้งสองชนิดนี้มีความทับซ้อนกันและแสดงถึงการจัดประเภทที่แตกต่างกัน (Wang D.-Y. et al., 2019) สิ่งนี้ทำให้จำเป็นต้องศึกษาลักษณะความหลากหลายของ TNBC เพื่อชี้แจงการพยากรณ์โรคและระบุการตอบสนองต่อการรักษาในปัจจุบันและอนาคต นอกจากนี้ TNBC คิดเป็น 15–20% ของผู้ป่วยมะเร็งเต้านมทั้งหมดและพบได้บ่อยในผู้หญิงที่มีอายุต่ำกว่า 50 ปี มีการรายงานการกลายพันธุ์ของยีน BRCA1 หรือ BRCA2 ในผู้ป่วยมะเร็งเต้านมชนิด TNBC ประมาณ 20% (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020) นอกจากนี้ การศึกษาต่างๆ ยังแสดงให้เห็นว่า TNBC มีสภาพแวดล้อมจุลภาคทางภูมิคุ้มกันที่แตกต่างออกไป ซึ่งรวมถึงระดับของปัจจัยการเจริญเติบโตของหลอดเลือด (VEGF) แมโครฟาจที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก (TAM) ลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอก (TIL) และโมเลกุลอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับการเจริญเติบโตและการแพร่กระจายของเนื้องอก ดังนั้น การทำความเข้าใจสภาพแวดล้อมจุลภาคของ TNBC จึงมีความสำคัญต่อการพยากรณ์โรคและการรักษา (Fan and He, 2022)
เพื่อประเมินพยากรณ์โรคของมะเร็งเต้านมชนิด TNBC และเพื่อให้แน่ใจว่าการรักษาได้ผล การวินิจฉัยที่แม่นยำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งการตรวจทางอิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) เพื่อตรวจหา ER, PR และ HER2 และการตรวจแมมโมแกรมเพื่อตรวจหาเนื้องอกในเต้านม มีความสำคัญ อย่างไรก็ตาม แมมโมแกรมไม่สามารถแสดงลักษณะภายในเนื้องอกได้อย่างเพียงพอ เช่น เนื้อตายและพังผืด (Deepak Singh et al., 2021) เนื่องจากพยากรณ์โรคและการวินิจฉัยที่ไม่ดีทำให้แพทย์ไม่สามารถสั่งยาที่ถูกต้องได้ (Chaudhary, 2020) จึงมีการใช้กลยุทธ์ต่างๆ เพื่อปรับปรุงการดูแลผู้ป่วย TNBC ปัจจุบัน ยา 2 ชนิด ได้แก่ ด็อกโซรูบิซินและไซโคลฟอสฟาไมด์ ถูกนำมาใช้ในผู้ป่วย TNBC และแสดงให้เห็นผลลัพธ์ที่ดี นอกจากนี้ ยังมีการใช้ยาแพลทินัมอื่นๆ เช่น คาร์โบแพลตินและซิสแพลติน (Sikov et al., 2015) นอกจากนี้ สารยับยั้ง PARP เช่น Olaparib, Velaparib และ PF-01367338 ถูกนำมาใช้เป็นยาเคมีบำบัดที่มีศักยภาพในการรักษา TNBC (Ishino et al., 2018) เนื่องจากมีรายงานว่าวิถีการส่งสัญญาณ Wnt/b-Catenin, NOTCH และ Hedgehog มีส่วนเกี่ยวข้องกับการเกิดและการลุกลามของ TNBC การกำหนดเป้าหมายยาไปยังวิถีเหล่านี้จึงอาจเป็นกลยุทธ์ที่สำคัญ (Aysola et al., 2013) แม้ว่าการผ่าตัด การฉายรังสี และเคมีบำบัดยังคงเป็นวิธีการรักษาหลักสำหรับ TNBC ในปัจจุบัน แต่ก็มีความก้าวหน้าอย่างมากในการพัฒนาวิธีการรักษาใหม่ๆ รวมถึงการรักษาแบบมุ่งเป้า การรักษาด้วยภูมิคุ้มกันบำบัด เครื่องมือแก้ไขยีนที่เกี่ยวข้องกับ CRISPR ต่างๆ เช่น Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing และการบำบัดยีนแบบมุ่งเป้าด้วย CRISPR/Cas9 ในที่นี้เราจะเน้นที่เครื่องมือแก้ไขยีนที่เกี่ยวข้องกับ CRISPR ต่างๆ ที่ใช้ในการรักษา TNBC ในบรรดาเทคโนโลยีเหล่านั้น CRISPR/Cas9 ได้รับความสนใจอย่างกว้างขวาง
Cas9n หรือที่รู้จักกันในชื่อ Cas9 nickase เป็นโปรตีน Cas9 ที่ได้รับการดัดแปลงทางพันธุกรรม ซึ่งได้มาจากระบบแก้ไขจีโนม CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019) ในรูปแบบดั้งเดิม โปรตีน Cas9 ประกอบด้วยโดเมนเอนไซม์นิวคลีเอสสองโดเมน ได้แก่ RuvC และ HNH ซึ่งมีหน้าที่หลักในการตัดสาย DNA ทั้งสองสาย อย่างไรก็ตาม ใน Cas9n โดเมนเอนไซม์นิวคลีเอสหนึ่งโดเมน คือ HNH ได้รับการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมและไม่ทำงาน ดังนั้น โดเมน HNH ของ Cas9n จึงไม่ทำงาน มีเพียงโดเมน RuvC เท่านั้นที่ยังคงทำงาน ทำให้ Cas9n สามารถตัดหรือสร้างรอยแตกบนสาย DNA เดี่ยวได้ (Trevino and Zhang, 2014) เมื่อเปรียบเทียบกับ Cas9 แล้ว Cas9n สามารถลดผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ได้อย่างมีประสิทธิภาพและปรับปรุงกลไกการซ่อมแซมเซลล์ได้อย่างแม่นยำ Cas9n สามารถนำมาใช้แก้ปัญหาต่างๆ ได้ เช่น การสร้างรอยแตกในตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจงใน DNA สองสาย เพื่อจุดประสงค์นี้ จึงมีการรวมโมเลกุล Cas9n สองโมเลกุลเข้าด้วยกันและนำมาใช้ร่วมกัน (Yee, 2016) Mixed lineage kinase 3 (MLK3) เป็นโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโทเจน ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมหลักในระหว่างการแพร่กระจายของมะเร็งเต้านมชนิด TNBC (Cronan et al., 2012)
MLK3 สามารถกระตุ้นวิถีการส่งสัญญาณหลายเส้นทางที่นำไปสู่การแพร่กระจายของมะเร็งเต้านมชนิด TNBC ตัวอย่างเช่น วิถีการส่งสัญญาณ c-Jun N-terminal kinase (JNK) ควบคุมการเคลื่อนที่ของเซลล์และการย่อยสลายเมทริกซ์นอกเซลล์ และ MLK3 จะกระตุ้นวิถีการส่งสัญญาณ JNK ทำให้การเคลื่อนที่ของเซลล์เพิ่มขึ้นและทำให้เกิดคุณสมบัติในการรุกราน (Rattanasinchai และ Gallo, 2016) MLK3 ยังควบคุม EMT ด้วย โดยจะกระตุ้นปัจจัยการถอดรหัสปลายทาง เช่น Snail, Slug และ Twist ปัจจัยเหล่านี้จะยับยั้งการแสดงออกของเครื่องหมายเยื่อบุผิวและส่งเสริมการแสดงออกของเครื่องหมายเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน นำไปสู่การได้รับลักษณะการแพร่กระจาย (Casalino et al., 2023) พบว่า MLK3 มีบทบาทในการปรับโครงสร้าง ECM และการกระตุ้นโปรตีเอส เช่น matrix metalloproteinases (MMPs) ที่ย่อยสลาย ECM สิ่งนี้ช่วยอำนวยความสะดวกในการบุกรุกและแพร่กระจายของเซลล์มะเร็งไปยังบริเวณที่ห่างไกล (Katari et al., 2019) ดังนั้น การศึกษาในอดีตแสดงให้เห็นว่า MLK3 มีบทบาทสำคัญใน TNBC Rattanasinchai และ Gallo ใช้แบบจำลอง TNBC เพื่อศึกษาบทบาทของ MLK3 และพบว่ามันส่งเสริมการพัฒนาของมะเร็งผ่านทางเส้นทางการส่งสัญญาณเฉพาะ พวกเขาใช้ CRISPR/Cas9n ในการแก้ไข MLK3 และสังเกตเห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของการแพร่กระจายของ TNBC (Rattanasinchai และ Gallo, 2016)
dCas9 หรือที่เรียกกันว่า Cas9 ที่ไม่ทำงาน เป็นรูปแบบอนุพันธ์ที่ดัดแปลงมาจากโปรตีน Cas9 แตกต่างจาก Cas9 ที่ทำงานได้ dCas9 ขาดกิจกรรมเอนโดนิวคลีเอส ทำให้ไม่สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดการแตกของสายดีเอ็นเอสองสายได้ ดังนั้น dCas9 จึงสามารถใช้เพื่อกำหนดเป้าหมายไปยังบริเวณเฉพาะของจีโนมได้อย่างแม่นยำโดยไม่ต้องเปลี่ยนแปลงหรือดัดแปลงลำดับดีเอ็นเอ (Wang et al., 2016) ใน dCas9 โปรตีนเอนโดนิวคลีเอสสองชนิด ได้แก่ RuvC และ HNH จะถูกทำให้ไม่ทำงานโดยการยับยั้งกรดอะมิโนที่สำคัญ (Richter et al., 2016) แม้จะขาดกิจกรรมการตัดดีเอ็นเอ แต่ dCas9 ก็มีบทบาทสำคัญหลายประการในการวิจัยทางพันธุกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพ ตัวอย่างเช่น ช่วยให้เห็นภาพบริเวณเฉพาะของจีโนม อำนวยความสะดวกในการควบคุมการถอดรหัส และส่งเสริมการดัดแปลงทางเอพิเจเนติกส์ (Brocken et al., 2018)
ปัจจัยการถอดรหัส ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) มีบทบาทเฉพาะและสำคัญในการเป็นตัวกลางในการเปลี่ยนแปลงจากเซลล์เยื่อบุผิวเป็นเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (Epithelial-mesenchymal transition หรือ EMT) ซึ่งเป็นกระบวนการที่เกิดขึ้นในระหว่างการพัฒนาของตัวอ่อน การซ่อมแซมเนื้อเยื่อ และการลุกลามของมะเร็ง กระบวนการนี้เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของเซลล์เยื่อบุผิวไปเป็นเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในรูปร่างของเซลล์ การเคลื่อนที่ การบุกรุก ฯลฯ (Wu et al., 2020) ZEB1 ยับยั้งเครื่องหมายเยื่อบุผิวหลายชนิด เช่น E-cadherin และ Occludin ซึ่งมีหน้าที่ในการรักษาการยึดเกาะระหว่างเซลล์และขั้วของเซลล์เยื่อบุผิวใน TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008) นอกจากนี้ ZEB1 ยังกระตุ้นตัวบ่งชี้บางอย่าง เช่น N-cadherin, vimentin และ fibronectin (Konradi et al., 2014) และยังควบคุมยีนที่เกี่ยวข้องกับการปรับโครงสร้างของไซโตสเกเลตัน เช่น Rho GTPases และ matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang et al., 2014) 2022) นอกจากนี้ยังส่งผลต่อเส้นทางการส่งสัญญาณต่างๆ เช่น transforming growth factor-β (TGF-β), การส่งสัญญาณ Wnt เป็นต้น ซึ่งส่งเสริมการรุกรานและการแพร่กระจายของเนื้องอกใน TNBC (Chen et al., 2016) งานวิจัยและหลักฐานทางวิทยาศาสตร์จำนวนมากบ่งชี้ว่า ZEB1 มีศักยภาพสูงในการเป็นตัวแทนที่มีคุณค่าสำหรับการตรวจจับและการรักษา TNBC ในการศึกษาล่าสุด Waryah et al. ใช้แบบจำลอง TNBC และประสบความสำเร็จในการยับยั้ง ZEB1 อย่างสมบูรณ์โดยใช้ dCas9 ดังนั้น พวกเขาจึงสังเกตเห็นความจำเพาะสูงมากและการยับยั้ง ZEB1 เกือบสมบูรณ์ในสภาวะในร่างกาย (Waryah et al., 2023)
CRISPR/Cas12 เป็นเครื่องมือแก้ไขยีนที่เรียกว่า CRISPR/Cpf1 ซึ่งพัฒนามาจากระบบ CRISPR/Cas โดยคำว่า Cas12 หมายถึงโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ CRISPR หมายเลข 12 (Bharathkumar et al., 2022) ซึ่งคล้ายคลึงกับ Cas9 อย่างมาก ความแตกต่างเพียงอย่างเดียวคือ Cas12 มีโปรตีน Cas12 อยู่ด้วย เมื่อเปรียบเทียบกับ Cas9 แล้ว Cas12 มีคุณสมบัติเฉพาะบางอย่าง เช่น การสร้างปลายเหนียว (sticky ends) ในกระบวนการแก้ไขยีน ในขณะที่ Cas9 สร้างปลายทู่ (blunt ends) (Wang et al., 2021) คุณสมบัตินี้ของ Cas12 ช่วยให้เทคโนโลยีการจัดการ DNA ของมันมีความเฉพาะเจาะจง ในฐานะโปรตีนที่สามารถจดจำและตัด DNA เป้าหมายได้อย่างแม่นยำ มันจึงมีความสามารถรอบด้านอย่างเหลือเชื่อ ทำให้เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการใช้งานที่หลากหลาย รวมถึงการแก้ไขยีน (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019)
เช่นเดียวกับ CRISPR รูปแบบอื่นๆ CRISPR/Cas12 ก็สามารถยับยั้งหรือกระตุ้นยีนใน TNBC ได้เช่นกัน โดยกำหนดเป้าหมายไปที่ยีนที่มีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคหรือการตอบสนองต่อการรักษา (Yang และ Zhang, 2023) เพื่อให้กระบวนการนี้สำเร็จลุล่วง จึงมีการพัฒนา guide RNA (gRNA) ขึ้นมาเพื่อนำทาง Cas12 ไปยังยีนเป้าหมาย เมื่อ Cas12 จับกับเป้าหมายแล้ว มันจะทำให้เกิดการแตกของสาย DNA สองสายและกระตุ้นกลไกการซ่อมแซม DNA ในระหว่างกระบวนการซ่อมแซม อาจมีการใส่สารนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ถูกต้องเข้าไป ทำให้เกิดการกลายพันธุ์ของยีนและสูญเสียการทำงาน (Zhang et al., 2021a) นอกจากนี้ ยังมีการใช้เอนไซม์ Cas12 เวอร์ชันปรับปรุง (เรียกว่า dCas12) เพื่อกระตุ้นยีนด้วย การรวม dCas12 เข้ากับตัวกระตุ้นการถอดรหัสทำให้สามารถเหนี่ยวนำยีนบางตัวและกระตุ้นให้ยีนเหล่านั้นทำงานได้ เทคโนโลยีนี้มีศักยภาพอย่างมากในการส่งเสริมการทำงานของยีนยับยั้งเนื้องอก (Sultan et al., 2022)
การแก้ไขแบบไพรม์เอดิตติ้ง (Primer editing) เป็นเทคโนโลยีการแก้ไขจีโนมที่พัฒนาขึ้นใหม่และมีประสิทธิภาพสูง สามารถปรับเปลี่ยนดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตได้อย่างแม่นยำมาก (Chen และ Liu, 2023) การแก้ไขแบบไพรม์เอดิตติ้งเกิดขึ้นจากการทำงานร่วมกันของสององค์ประกอบหลัก ได้แก่ เอนไซม์ CRISPR/Cas9 ที่ได้รับการดัดแปลง และเอนไซม์รีเวอร์สทรานสคริปเทส บทบาทของเอนไซม์ CRISPR/Cas9 คือการเลือกเป้าหมายไปยังตำแหน่งที่แม่นยำในจีโนม ในขณะที่เอนไซม์รีเวอร์สทรานสคริปเทสช่วยในการปรับเปลี่ยนดีเอ็นเอ ณ ตำแหน่งเป้าหมายอย่างละเอียด (Hassan et al., 2021) ในกลไกการแก้ไขแบบไพรม์เอดิตติ้ง ขั้นตอนแรกเกี่ยวข้องกับการสร้าง RNA นำทางสำหรับการแก้ไขแบบไพรม์เอดิตติ้ง (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021) ซึ่งประกอบด้วยลำดับเป้าหมายและแม่แบบ RNA ที่สอดคล้องกับตำแหน่งการแก้ไขที่ต้องการในดีเอ็นเอเป้าหมาย จากนั้น pegRNA จะถูกนำเข้าสู่เซลล์เป้าหมายพร้อมกับนิวคลีเอสสำหรับการแก้ไขแบบไพรม์เอดิตติ้ง (PE2) PE2 เป็นโปรตีนลูกผสมที่ประกอบด้วยเอนไซม์ Cas9, รีเวอร์สทรานสคริปเทส และอะแดปเตอร์สำหรับแก้ไขไพรเมอร์ (Martín-Alonso et al., 2021) ภายในเซลล์ คอมเพล็กซ์ pegRNA และ PE2 จะค้นหา DNA ที่ต้องการแก้ไข เอนไซม์ Cas9 จะตัด DNA และสร้างแม่แบบที่ประกอบด้วยสายเดี่ยว (Choi et al., 2022) รีเวอร์สทรานสคริปเทสจะใช้แม่แบบนี้ในการเตรียม DNA สำหรับการแก้ไข นอกจากการคัดลอก DNA แล้ว ยังมีคำสั่งสำหรับการแก้ไขแม่แบบ RNA รวมอยู่ด้วย สุดท้าย สาย DNA ที่สร้างขึ้นใหม่จะถูกใช้เป็นแม่แบบในการซ่อมแซมรอยแตกใน DNA ส่งผลให้ลำดับ DNA ที่เปลี่ยนแปลงไปมีการดัดแปลงตามที่ต้องการ (Ochoa-Sanchez et al., 2021) กลไกการแก้ไขไพรเมอร์อาจนำไปสู่การกลายพันธุ์ในยีนอย่างกว้างขวาง เทคนิคนี้สามารถกำหนดเป้าหมายการกลายพันธุ์แบบจุด การแทรก การลบ และแม้กระทั่งการแทนที่ยีน (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023) การแก้ไขแบบไพรม์เอดิตติ้งมีข้อดีหลายประการเหนือเทคโนโลยีการแก้ไขจีโนมแบบเดิม ซึ่งรวมถึงความแม่นยำที่เพิ่มขึ้น ผลกระทบที่ไม่ตรงเป้าหมายลดลง และความสามารถในการแก้ไข DNA โดยไม่ต้องอาศัยการแตกของสาย DNA สองสาย (Anzalone et al., 2020)
เทคโนโลยี CRISPR/Cas9 เดิมพัฒนาขึ้นเพื่อปกป้องแบคทีเรียจากการถ่ายโอนพลาสมิดและการติดเชื้อไวรัสฟาจ และต่อมาได้ถูกนำมาใช้ใหม่เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการกำหนดเป้าหมาย DNA โดยใช้ RNA สำหรับการแก้ไขจีโนม (Jiang และ Doudna, 2017) นอกจากนี้ ยังมีรายงานว่าระบบ CRISPR/Cas9 พบได้ในจีโนมของแบคทีเรีย 50% และอาร์เคีย 87% ตามลำดับ (Ishino et al., 2018) CRISPR/Cas9 เป็นเครื่องมือที่มีศักยภาพสำหรับการลบ การแทรก และการแก้ไขลำดับทางพันธุกรรมที่ผิดปกติใดๆ โดยใช้โหมดในร่างกายและนอกร่างกาย (Sabit et al., 2021) ยิ่งไปกว่านั้น CRISPR/Cas9 ยังแสดงให้เห็นว่าเป็นส่วนหนึ่งของระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวได้ เนื่องจากมีความจำเพาะต่อยีนเป้าหมายที่สนใจ (Chen และ Zhang, 2018)
CRISPR/Cas9 ประกอบด้วย Cas9 และ RNA นำทางเดี่ยว (sgRNA) Cas9 เป็นเอนโดนิวคลีเอสที่ประกอบด้วยส่วนประกอบโปรตีนหลายชนิด นอกจากนี้ Cas9 ยังมีคุณสมบัติเชิงโครงสร้างและรูปร่างที่เป็นเอกลักษณ์ (Pacesa et al., 2022) เนื่องจากประกอบด้วยสองส่วน คือ ส่วนรับรู้ (REC) และส่วนนิวคลีเอส (NUC) ส่วน REC แบ่งออกเป็นสามส่วนย่อย คือ REC1, REC2 และเกลียวเชื่อม (Cromwell et al., 2018) ส่วน NUC ประกอบด้วยสามส่วนย่อย คือ RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH และโดเมนปฏิสัมพันธ์ของโมทีฟที่อยู่ติดกับโปรโตสเปเซอร์ (PAM) (รูปที่ 1) (Song et al., 2016) sgRNA ประกอบด้วยสองส่วนประกอบ คือ CRISPR RNA (crRNA) และ RNA ขนาดเล็กที่เข้ารหัส (tracer RNA) (รูปที่ 1) sgRNA เชื่อมต่อโปรตีน Cas9 กับคอนเน็กซินเพื่อสร้างคอมเพล็กซ์ที่ทำงานได้ หรือที่เรียกว่าคอมเพล็กซ์เอฟเฟกเตอร์ (Richter et al., 2012) crRNA เป็นเบสคู่ 18-20 นิวคลีโอไทด์ที่มีบทบาทสำคัญในการจดจำลำดับ DNA เป้าหมาย นอกจากนี้ crRNA ยังจับคู่กับ DNA เป้าหมาย และ tracrRNA ทำหน้าที่เป็นโครงสร้างรองรับให้เอนไซม์นิวคลีเอส Cas9 จับกับ DNA เป้าหมาย (Manghwar et al., 2019) ในทางกลับกัน ลำดับ PAM มีนิวคลีโอไทด์ 3 ตัว ซึ่งยืนยัน ระบุ และเป็นตัวกลางในการจับกันของคอมเพล็กซ์เอฟเฟกเตอร์กับ DNA หน่วยย่อย RuvC และ HNH ของโปรตีนคอมเพล็กซ์ Cas9 มีกิจกรรมเร่งปฏิกิริยา (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021) โดเมนเอนไซม์นิวคลีเอส HNH ของหน่วยย่อย Cas9 จะตัดสาย DNA ที่เกี่ยวข้องกับ crRNA โดเมนนิวคลีเอสของ RuvC จะตัดสาย DNA อื่นๆ และสร้างการแตกหักแบบสองสาย (DSBs) หลังจากนั้นกลไกการซ่อมแซมการแตกหักของ DNA สองแบบที่แตกต่างกันจะถูกกระตุ้น (Jiang และ Doudna, 2017) (รูปที่ 1)
รูปที่ 1 ภาพรวมของ CRISPR/Cas9 (A) ส่วนประกอบของระบบ CRISPR/Cas9: (i) เอนโดนิวคลีเอส Cas9 ทำหน้าที่ตัดลำดับ DNA เป้าหมาย (ii) อาร์เอ็นเอไกด์เดี่ยว (sg-RNA) ที่เกิดจากการรวมกันของไคเมอรา crRNA และ tra-crRNA (สอง) Cas9 ประกอบด้วยส่วนประกอบหลายอย่าง เช่น Rec I, Rec II, NUC lobe (HNH และ Ruv C เป็นส่วนประกอบย่อย) และโดเมนปฏิสัมพันธ์ PAM (C) พร้อมหน้าที่ที่เกี่ยวข้อง โปรตีนคอมเพล็กซ์ CRISPR/Cas9 จะตัดลำดับ DNA ออกเป็นรูปแบบที่ไม่เสริมกันและรูปแบบที่เสริมกัน (D) CRISPR/Cas9 แก้ไขจีโนมในสามขั้นตอน: การจดจำ การตัด และการซ่อมแซม sg-RNA ที่ออกแบบไว้จะนำทาง Cas9 และจดจำลำดับที่ต้องการผ่าน crRNA ส่วนประกอบที่เสริมกัน Cas9 จดจำลำดับ PAM ที่ 5′-NGG-3′ และหลอม DNA ทำให้เกิดไฮบริด DNA-RNA และกระตุ้นการตัด โดเมน HNH ของ Cas9 จะตัดสายดีเอ็นเอที่เข้าคู่กัน และโดเมน RuvC จะตัดสายดีเอ็นเอที่ไม่เข้าคู่กัน CRISPR/Cas9 ซ่อมแซมดีเอ็นเอสองสายโดยการตัดในสองวิธี ได้แก่ การเชื่อมต่อปลายที่ไม่เหมือนกัน (NHEJ) และการซ่อมแซมโดยใช้ลำดับดีเอ็นเอที่เหมือนกัน (HDR) NHEJ ซ่อมแซมดีเอ็นเอสองสายในกรณีที่ไม่มีดีเอ็นเอที่เหมือนกันจากภายนอก ผ่านกระบวนการทางเอนไซม์ ซึ่งเป็นกลไกที่อาจเกิดข้อผิดพลาดได้ และสามารถแทรกหรือลบลำดับดีเอ็นเอแบบสุ่มได้ HDR มีความจำเพาะสูงและต้องการแม่แบบดีเอ็นเอที่เหมือนกัน
กลไกการซ่อมแซมดีเอ็นเอด้วย CRISPR/Cas9 ประกอบด้วยกลไกการเชื่อมต่อปลายที่ไม่เหมือนกัน (NHEJ) และกลไกการซ่อมแซมโดยใช้ความเหมือนกัน (HDR) NHEJ เป็นกลไกที่มีโอกาสผิดพลาดสูง เนื่องจากเกี่ยวข้องกับการแทรกหรือการลบ และไม่ต้องการรูปแบบใดๆ ในกลไกการซ่อมแซม โดยใช้เบสนิวคลีโอไทด์แบบสุ่มเพื่อสร้างโปรตีนมาตรฐาน (Abbasi et al., 2021) ระบบการซ่อมแซมนี้ประกอบด้วยคอมเพล็กซ์สี่ชนิด ได้แก่ คอมเพล็กซ์ KU, คอมเพล็กซ์โปรตีนเสริมชนิดที่ 4 (XRCC-4), เอนไซม์ประมวลผลปลายดีเอ็นเอ และโปรตีนไคเนส DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021) โปรตีนคอมเพล็กซ์ KU ประกอบด้วยสองหน่วยย่อย คือ Ku 70 และ Ku 80 และมีบทบาทสำคัญในกลไก NHEJ เนื่องจากกลไกการซ่อมแซมเริ่มต้นจากการจับกันของสองหน่วยย่อย (Ku 70 และ Ku 80) กับปลายทู่หรือเกือบทู่ของ DNA เป้าหมาย (Abbasi et al., 2021) ทำหน้าที่เป็นโครงสร้างเพื่อดึงดูดปัจจัยอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับ NHEJ มายังบริเวณที่ได้รับบาดเจ็บ (Yang et al., 2020) XRCC-4 และ DNA ligase ประกอบด้วยกรดอะมิโน 334 และ 911 ตัว ตามลำดับ และคอมเพล็กซ์ XRCC4-DNA ligase IV กระตุ้นการเชื่อมต่อปลาย DNA (Chatterjee et al., 2015) เอนไซม์ประมวลผลปลาย DNA หรือที่รู้จักกันในชื่อ polynucleotide kinase 3′-phosphate เป็นเอนไซม์ประมวลผลปลาย DNA เอนไซม์นี้สามารถกำจัดหมู่ 3′P ใน DNA และเติมหมู่ฟอสเฟตให้กับหมู่ 5′OH ในระหว่างการซ่อมแซม DSB นอกจากนี้ยังเกี่ยวข้องกับการซ่อมแซมรอยแตกสายเดี่ยว (SSB) โดยใช้เส้นทางการซ่อมแซม SSB (Chatterjee et al., 2015) โปรตีนไคเนส DNA-PKcs เป็นโปรตีนไคเนสที่ขึ้นอยู่กับ DNA ซึ่งประกอบด้วยหน่วยย่อยเร่งปฏิกิริยาของตระกูล PIKKs (phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases) และตระกูล ataxia telangiectasia mutated (ATM) รวมถึง ATM และ Rad3-related ATRs ด้วย
HDR เป็นกลไกการซ่อมแซมที่แม่นยำและเหมาะสมกว่า เนื่องจากข้อมูลถูกคัดลอกโดยใช้รูปแบบที่สมบูรณ์ของดีเอ็นเอคู่โฮโมล็อกัส แม้ว่าจะต้องมีโครมาทิดคู่แฝดอยู่ด้วยก็ตาม กระบวนการนี้เกิดขึ้นในช่วงระยะ S/G2 ของวงจรเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม HDR เกิดขึ้นส่วนใหญ่ในยีสต์ แต่ NHEJ มีความสำคัญอย่างยิ่งในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021) กลไกการซ่อมแซมที่สมบูรณ์แสดงในรูปที่ 1
เนื่องจากมะเร็งเต้านมชนิด TNBC เกิดจากความผิดปกติทางพันธุกรรมและเอพิเจเนติกส์ การแก้ไขความผิดปกติทางจีโนม/เอพิเจโนมที่เป็นมะเร็งโดยใช้ CRISPR/Cas9 อาจเป็นแนวทางการรักษาที่เหมาะสม (Chen et al., 2019) นอกจากนี้ ปัจจัยการถอดรหัสบางอย่างที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมการถอดรหัสเฉพาะเซลล์อาจแสดงลักษณะเฉพาะของเซลล์มะเร็ง ซึ่งบ่งชี้ว่าการควบคุมการถอดรหัสอาจเป็นแนวทางที่ดีเยี่ยมสำหรับการรักษามะเร็ง (Drost et al., 2017) การใช้ประโยชน์จากคุณลักษณะทางโมเลกุลของเนื้องอก เช่น ข้อบกพร่องทางพันธุกรรม เอพิเจเนติกส์ และการถอดรหัส ในการพัฒนายา สามารถปรับปรุงผลลัพธ์ทางคลินิกและลดต้นทุนการตรวจคัดกรองได้ CRISPR เป็นเครื่องมือแก้ไขยีนที่มีศักยภาพ ซึ่งไม่เพียงแต่สามารถตรวจจับและระบุเป้าหมายทางจีโนมที่ก่อให้เกิดมะเร็งได้เท่านั้น แต่ยังสามารถใช้เพื่อแก้ไข ยับยั้ง และปรับเปลี่ยนเอพิเจเนติกส์ของยีนที่ก่อให้เกิดมะเร็งในเซลล์มนุษย์ได้อีกด้วย (ตารางที่ 1) (Ahmed et al., 2021) มีการดำเนินการคัดกรองด้วย CRISPR หลายครั้งเพื่อค้นหายีนที่เกี่ยวข้องกับยีนยับยั้งเนื้องอก ยีนก่อเนื้องอก และการดื้อยา การใช้ CRISPR/Cas9 ในการแก้ไขยีนก่อเนื้องอก TNBC ต่างๆ แสดงไว้ในรูปที่ 2
รูปที่ 2 การแก้ไขยีนของออนโคยีน TNBC ต่างๆ โดยใช้ CRISPR/Cas9 ส่งผลให้การเจริญเติบโตและการแพร่กระจายของเนื้องอกลดลง ออนโคยีนเหล่านี้ได้แก่ CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 และ CXCR7, Crypto1, ROR1 และ ST8SIA ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเกิดและการแพร่กระจายของ TNBC
การเคลื่อนย้าย การรุกราน และการเปลี่ยนแปลงจากเซลล์เยื่อบุผิวเป็นเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (EMT) ของเซลล์มะเร็งมีความเกี่ยวข้องกับ ITGA9 งานวิจัยก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า ITGA9 เป็นตัวสำคัญในวิถี Notch และมีบทบาทสำคัญในการแพร่กระจายของมะเร็งกล้ามเนื้อลาย (Molist et al., 2020) นอกจากนี้ ยังพบว่า ITGA9 มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการพยากรณ์โรคของผู้ป่วยในมะเร็งหลายชนิด รวมถึงมะเร็งเต้านม (Wang Z. et al., 2019) ยิ่งไปกว่านั้น การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศของ ITGA9 แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ ITGA9 ใน TNBC สูงกว่าในมะเร็งเต้านมชนิดอื่นๆ อย่างมีนัยสำคัญ ระดับ ITGA9 ที่สูงขึ้นมีความสัมพันธ์กับการแพร่กระจายและการกลับมาเป็นซ้ำของเนื้องอกในผู้ป่วย TNBC การกำจัดยีน ITGA9 ด้วย CRISPR/Cas9 ส่งผลให้เกิดคุณสมบัติคล้ายเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง (CSC) การสร้างหลอดเลือดใหม่ในเนื้องอก การเติบโตของเนื้องอก และการลดการแพร่กระจายโดยการส่งเสริมการสลายตัวของ β-catenin ใน TNBC (Wang Z. et al., 2019)
Crypto-1 เป็นสมาชิกของกลุ่ม TGF-β และมีความสำคัญต่อการเจริญเติบโตของตัวอ่อนในระยะเริ่มต้น การรักษาสภาพเซลล์ต้นกำเนิด และการแพร่กระจายของมะเร็ง (Ishii et al., 2021) หรือที่รู้จักกันในชื่อ Tdgf-1 เป็นโปรตีนส่งสัญญาณที่ยึดติดกับ GPI ซึ่งมีบทบาทในการควบคุมการก่อตัวของร่องดั้งเดิม เมโซเดอร์ม และเอนโดเดอร์ม รวมถึงการสร้างความไม่สมมาตรซ้าย/ขวาในการพัฒนาอวัยวะต่างๆ ของร่างกายในระหว่างการเจริญเติบโตของตัวอ่อน (Zhang et al., 2021b) นอกจากนี้ Crypto-1 ยังแสดงให้เห็นว่ามีส่วนเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงจากเซลล์เยื่อบุผิวเป็นเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (EMT) ในฐานะเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิด (Zhang et al., 2021b) EMT มีความสำคัญไม่เพียงแต่ต่อกระบวนการต่างๆ เช่น การเจริญเติบโตของตัวอ่อน การเกิดพังผืด และการสมานแผล แต่ยังรวมถึงการรุกรานและการแพร่กระจายของมะเร็งด้วย นอกจากนี้ ยังพบว่า Crypto-1 มีปฏิสัมพันธ์กับตัวรับ Notch สี่ชนิดและช่วยเสริมการเจริญเติบโตหลังการแปลรหัส (Brandstadter และ Maillard, 2019) เป็นที่ทราบกันดีว่าวิถีการส่งสัญญาณ Notch มีส่วนเกี่ยวข้องกับการรักษาสภาพของเซลล์มะเร็งเต้านมในมนุษย์ การศึกษาต่างๆ แสดงให้เห็นว่าการกำจัดยีน Crypto-1 ด้วย CRISPR/Cas9 สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตและการแพร่กระจายของมะเร็งได้ ดังนั้น Crypto-1 อาจกลายเป็นเป้าหมายการรักษาที่สำคัญสำหรับ TNBC (Castro et al., 2015)
โปรตีน XCL12 และตัวรับเคโมไคน์ CXC (CXCR4 และ CXCR7) มีบทบาทหลากหลายในการเพิ่มจำนวน การเจริญเติบโต การเคลื่อนย้าย และการรุกรานของเซลล์มะเร็ง (Wu et al., 2015) เคโมรีเซปเตอร์เหล่านี้มีความเกี่ยวข้องกับการพัฒนาของมะเร็งเต้านมชนิด TNBC ผ่านทางเส้นทางการส่งสัญญาณหลายเส้นทางทั้งในแบบจำลองในร่างกายและในหลอดทดลอง (Wu et al., 2015) นอกจากนี้ การกระตุ้น CXCR4 และ CXCR7 ยังเกี่ยวข้องกับความเสี่ยงต่อการแพร่กระจายและการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีใน TNBC (Karn et al., 2022) ดังนั้น การกำจัดยีน CXCR4 และ CXCR7 อาจกลายเป็นยีนเป้าหมายที่มีประสิทธิภาพสำหรับการรักษาโรคมะเร็งเต้านม รวมถึง TNBC (จากการศึกษาของ Yang et al.) Yang et al (2019) ใช้ CRISPR/Cas9 เพื่อทำการ co-knock out ยีน CXCR4 และ CXCR7 และพบว่าการแพร่กระจาย การเจริญเติบโต การเคลื่อนย้าย และการรุกรานของ TNBC ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญ (Yang et al, 2019)
มีการตรวจพบระดับ miR-3662 ซึ่งเป็นยีนก่อมะเร็งเต้านมชนิด TNBC เพิ่มสูงขึ้นในเนื้อเยื่อมะเร็งเต้านม (Yi et al., 2022) การลดระดับ miR-3662 แสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตและการแพร่กระจายของเนื้องอกมะเร็งเต้านมได้ทั้งในร่างกายและในหลอดทดลอง (Agarwal and Gupta, 2021) HBP-1 เป็นตัวยับยั้งที่มีประสิทธิภาพของสัญญาณ Wnt/-catenin และน่าจะเป็นตัวการสำคัญในการกระตุ้นการเจริญเติบโตของเซลล์ TNBC ผ่าน miR-3662 เมื่อเร็วๆ นี้ Yi et al. พบว่าแกน miR-3662-HBP1 ควบคุมวิถีการส่งสัญญาณ Wnt/-catenin ในเซลล์ TNBC (Yi et al., 2022) เนื่องจากการแสดงออกที่จำเพาะต่อเนื้องอก miR-3662 จึงอาจเป็นเป้าหมายการรักษาที่มีศักยภาพสำหรับ TNBC ดังนั้น การลดระดับ miR-3662 ด้วยเทคโนโลยี CRISPR/Cas9 อาจเป็นแนวทางที่ยอดเยี่ยมในการพัฒนายาใหม่สำหรับการรักษาโรคมะเร็งเต้านมชนิด TNBC
UBR5 เป็นโปรตีนนิวคลีโอฟอสโฟโปรตีนขนาด 300 kDa ที่ได้รับการระบุว่าเป็นตัวควบคุมหลักของการเกิดเนื้องอก การแพร่กระจาย และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในมะเร็งหลายชนิด (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023) มีรายงานว่า UBR5 มีการแสดงออกสูงขึ้นอย่างมากในตัวอย่าง TNBC และกระตุ้นการทำงานของ ERα โดยการเหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนเซลล์ผ่านกิจกรรมยูบิควิตินไลเกส (Bolt et al., 2015) การศึกษาลำดับจีโนมทั้งหมดของตัวอย่าง TNBC ขั้นต้นยังแสดงให้เห็นถึงการแสดงออกของ UBR5 ที่เพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทของมันในการพัฒนา TNBC นอกจากนี้ การลบ UBR5 ด้วย CRISPR/Cas9 แสดงให้เห็นถึงการยับยั้งการแพร่กระจายและการเจริญเติบโตของ TNBC อย่างมีนัยสำคัญในแบบจำลองหนูทดลอง นอกจากนี้ การรวม UBR5 เข้าไปในแบบจำลองหนูสายพันธุ์ปกติทำให้การทำงานกลับมาสมบูรณ์ ในขณะที่ไม่พบผลดังกล่าวในสายพันธุ์กลายพันธุ์ที่ถูกทำให้ไม่ทำงาน (Liao et al., 2017) การขาด UBR5 เกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของอะพอพโทซิส เนโครซิส และการยับยั้งการเจริญเติบโตของเนื้องอกใน TNBC เนื่องจากการสร้างหลอดเลือดที่ไม่ดี เนื่องจากการสูญเสีย UBR5 การแพร่กระจายของเนื้องอกไปยังอวัยวะที่อยู่ห่างไกลจึงลดลง และ UBR5 กระตุ้นให้เกิด EMT ที่ผิดปกติโดยส่วนใหญ่โดยการลดการแสดงออกของ E-cadherin (Zhang and Weinberg, 2018) เมื่อเร็วๆ นี้ พบว่า UBR5 เป็นปัจจัยสำคัญมากในการถอดรหัส PDL1 ที่ถูกกระตุ้นโดย IFN-γ ใน TNBC เนื่องจากขาดกิจกรรมยูบิควิตินเนชัน E3 การวิเคราะห์ทรานสคริปโตมของ RNA เผยให้เห็นว่า UBR5 อาจมีผลกระทบต่อระบบในยีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นทาง IFN-γ และส่งเสริมการกระตุ้นการถอดรหัส PDL1 โดยการเพิ่มระดับการกระตุ้นของโปรตีนไคเนส RNA (PKR) และตัวส่งสัญญาณและตัวกระตุ้นของมัน การถอดรหัส 1 (STAT1) และปัจจัยควบคุมอินเตอร์เฟรอน 1 (IRF1) อย่างไรก็ตาม การทำลายการแสดงออกของ UBR5 และ PD-L1 ร่วมกันโดยใช้ CRISPR/Cas9 มีผลการรักษาแบบเสริมฤทธิ์กันมากกว่าการปิดกั้นเพียงอย่างใดอย่างหนึ่ง โดยมีผลกระทบอย่างมากต่อสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก (Wu et al., 2022) ดังนั้น CRISPR/Cas9 อาจเป็นเครื่องมือสำคัญในการยับยั้งการทำงานของ UBR5 ซึ่งจะช่วยยับยั้งการแพร่กระจายและการเติบโตของมะเร็งเต้านมชนิด TNBC
ROR1 เป็นโปรตีนทรานส์เมมเบรนชนิดที่ 1 ที่แสดงออกในระหว่างการเกิดมะเร็งและการพัฒนาของตัวอ่อน และได้รับการระบุว่าเป็นโปรตีนออนโคฟีทัล (Nicholas Borcherding, 2014) พฤติกรรมการรุกรานของมะเร็งในมนุษย์หลายชนิดมีความเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ ROR1 ผลลัพธ์ที่น่าสนใจได้มาจากการศึกษาในร่างกายและในหลอดทดลองที่เกี่ยวข้องกับสารประกอบบำบัดที่มุ่งเป้าไปที่ ROR1 (Chien et al., 2016) ระดับ mRNA ของ ROR1 ที่สูงขึ้นในชิ้นเนื้อเต้านมยังเกี่ยวข้องกับเนื้องอกเต้านมชนิดเบซัลไลค์ (BL) ที่รุนแรงและการแพร่กระจายไปยังส่วนอื่นๆ ของร่างกาย นอกจากนี้ การแสดงออกมากเกินไปของ ROR1 ยังได้รับการระบุว่าเป็นเครื่องหมายพยากรณ์โรคสำหรับการพัฒนาของ TNBC (Chien et al., 2016) อย่างไรก็ตาม การยับยั้งการแสดงออกของ ROR1 โดยใช้ CRISPR/Cas9 เพื่อยับยั้งการเจริญเติบโตและการแพร่กระจายของ TNBC จะเป็นกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพ
กระบวนการไซอาลิเลชันเกี่ยวข้องกับการเติมกรดไซอะลิกเข้าไปในไกลโคคอนจูเกต ซึ่งถูกเร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์ไซอาลิลทรานสเฟอเรส (STs) ST8SIA1 เป็นของตระกูล ST และมีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคต่างๆ เช่น มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดลิมโฟไซต์และมะเร็งลำไส้ใหญ่ (Chang et al., 2018) การวิเคราะห์ลำดับ RNA แสดงให้เห็นว่า ST8SIA1 มีการแสดงออกสูงในเนื้อเยื่อเต้านมของผู้ป่วย TNBC และมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการกลายพันธุ์ในยีนยับยั้งเนื้องอก p53 ซึ่งอาจมีส่วนทำให้เกิดโรค TNBC (Battula et al., 2017) นอกจากนี้ ST8SIA1 ยังเกี่ยวข้องกับการแพร่กระจายและการกลับมาเป็นซ้ำของ TNBC ซึ่งบ่งชี้ว่ามันมีบทบาทสำคัญในการเกิดและการพัฒนาของ TNBC ในแบบจำลองในหลอดทดลองของมะเร็งเต้านมชนิด TNBC การลดระดับการแสดงออกของยีน ST8SIA1 โดยใช้ CRISPR/Cas9 แสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตและการแพร่กระจายของมะเร็งได้ (Battula et al., 2017) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า CRISPR/Cas9 อาจเป็นเครื่องมือสำคัญในการยับยั้งการทำงานของยีนก่อมะเร็ง ST8SIA1 ในการรักษามะเร็งเต้านมชนิด TNBC
NAT1 เป็นเอนไซม์เมตาบอลิซึมที่เร่งปฏิกิริยาการสร้างสารประกอบต่างถิ่นระยะที่สอง และพบได้ในเนื้อเยื่อของมนุษย์เกือบทั้งหมด NAT1 สามารถใช้โคแฟคเตอร์โฟเลตในการกำหนดเป้าหมายอะเซทิล-โคเอ (acetyl-CoA) แม้ในกรณีที่ไม่มีสารตั้งต้นอะโรมาติกอะมีน (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014) การศึกษาแสดงให้เห็นว่า NAT1 ควบคุมการทำงานของเมทริกซ์เมทัลโลโปรตีเนส 9 (MMP9) ในแบบจำลองเซลล์มะเร็งเต้านมและป้องกันอนุมูลอิสระ (ROS) ในระหว่างการขาดกลูโคส (Wang et al., 2018) การลบ NAT1 แสดงให้เห็นว่ายับยั้งคอมเพล็กซ์ไพรูเวทดีไฮโดรจีเนส ทำให้เกิดความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย (Wang L. et al., 2019) นอกจากนี้ รายงานอื่นๆ อีกหลายฉบับแสดงให้เห็นว่า การยับยั้ง NAT1 โดยใช้โมเลกุลขนาดเล็กและการปิดกั้นด้วย siRNA สามารถลดการรุกรานและการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็งเต้านมได้ (Stepp et al., 2018) เมื่อไม่นานมานี้ มีการใช้ CRISPR/Cas9 เพื่อยับยั้ง NAT1 ในเซลล์มะเร็งเต้านมสายพันธุ์ MDA-MB-231 ซึ่งส่งผลต่อการเผาผลาญของเซลล์ขึ้นอยู่กับระดับการแสดงออกของ NAT1 การศึกษานี้ยังแสดงให้เห็นว่า NAT-1 มีความสำคัญต่อการลุกลามและการแพร่กระจายของ TNBC (Carlisle et al., 2020)
การถอดรหัสแบบประสานงานของยีนก่อมะเร็งถูกควบคุมโดยซูเปอร์เอนแฮนเซอร์ ปัจจัยการถอดรหัส และโคแฟคเตอร์ (Hnisz et al., 2015) นอกจากนี้ กลุ่มของไคเนสที่ขึ้นอยู่กับไซคลิน (CDKs) เช่น CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 และ CDK13 มีความจำเป็นสำหรับการควบคุมการถอดรหัส ในจำนวนนี้ CDK7 มีส่วนเกี่ยวข้องกับการฟอสโฟรีเลชันของ RNA polymerase II ซึ่งมีความสำคัญมากสำหรับการเริ่มต้นและการขยายตัวของการถอดรหัสยีนก่อมะเร็งในพยาธิกำเนิดของ TNBC ในการศึกษาครั้งสำคัญ การลบ CDK7 โดยใช้ CRISPR/Cas9 ยับยั้ง TNBC ซึ่งบ่งชี้ว่าพยาธิกำเนิดของ TNBC ขึ้นอยู่กับ CDK7 (Wang Y. et al., 2015)
จากการศึกษาพบว่า การกลายพันธุ์ในยีน MYC และ RBP (โปรตีนที่จับกับ RNA) สามารถนำไปสู่ภาวะอะพอพโทซิสได้ ในขณะที่การกลายพันธุ์ของยีน MYC หรือ RBP เพียงอย่างเดียวจะไม่ส่งผลต่อการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็ง (Einstein et al., 2021) มีการคัดกรอง RBP มากกว่า 1,000 ตัวในจีโนมมนุษย์โดยใช้ไลบรารีแบบ CRISPR/Cas9 และพบว่า RBP จำนวน 57 ตัวมีความสำคัญต่อการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งที่มีระดับ MYC สูง (Wheeler et al., 2020) นอกจากนี้ YTHDF2 ยังมีความสำคัญต่อการรักษาการเจริญเติบโตของเซลล์ TNBC และลดปริมาณของทรานสคริปต์ที่มีการเมทิลเลชั่นในระหว่างการถอดรหัสและการแปลระดับสูงในเซลล์มะเร็งที่มีการแสดงออกของ MYC สูงขึ้น นอกจากนี้ YTHDF2 ยังไม่จำเป็นต่อเซลล์มะเร็ง ซึ่งพึ่งพาระดับ MYC ที่สูงขึ้นน้อยกว่าในการยืดอายุการอยู่รอดของผู้ป่วย TNBC (Einstein et al., 2021) ซึ่งบ่งชี้ว่าอาจเป็นเป้าหมายการรักษาที่มีศักยภาพสำหรับยาที่สามารถเอาชนะ TNBC ได้
โปรตีนซิงค์ฟิงเกอร์ (ZNF) ประกอบขึ้นเป็นประมาณ 1% ของจีโนมมนุษย์ทั้งหมด การศึกษาต่างๆ แสดงให้เห็นว่า ZNF สามารถควบคุมการเพิ่มจำนวนเซลล์ในมะเร็งหลายชนิด เช่น มะเร็งตับ มะเร็งเต้านม และมะเร็งลำไส้ใหญ่ (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017) ไลบรารีที่สร้างขึ้นโดยการกำจัดยีนด้วย CRISPR ถูกนำมาใช้ในการคัดกรองยีนยับยั้งเนื้องอก (TSG) ต่างๆ ในเซลล์มะเร็งเต้านม (Shalem et al., 2014) ต่อมา การศึกษาทางด้านทรานสคริปโตมิกส์ของเซลล์มะเร็งเต้านมที่ถูกกำจัดยีน ZNF319 ด้วย CRISPR/Cas9 แสดงให้เห็นว่า ZNF319 เป็นยีนยับยั้งเนื้องอกที่ช่วยลดการเพิ่มจำนวนของเซลล์มะเร็งเต้านม และดังนั้นจึงมีส่วนเกี่ยวข้องกับกลไกการส่งสัญญาณต่างๆ และหน้าที่ทางชีวภาพอื่นๆ (Wang L. et al., 2022)
เฟอร์โรพโทซิส (Ferroptosis) เป็นการตายของเซลล์แบบมีโปรแกรมชนิดหนึ่งที่ขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของธาตุเหล็ก เป็นที่ทราบกันดีว่าการเกิดเฟอร์โรพโทซิสได้รับอิทธิพลจากการมีอยู่ของลิปิดเปอร์ออกไซด์ นอกจากนี้ ยังมีรายงานว่า PKCβII แสดงให้เห็นถึงการเกิดลิปิดเปอร์ออกไซด์ในระยะเริ่มต้น และการเพิ่มขึ้นของลิปิดเปอร์ออกไซด์มีความเกี่ยวข้องกับเฟอร์โรพโทซิส การคัดกรองสารยับยั้งไคเนสที่ใช้ CRISPR/Cas9 พบว่า PKCβII มีส่วนเกี่ยวข้องในกระบวนการเกิดลิปิดเปอร์ออกไซด์ ซึ่งมีความสำคัญต่อเฟอร์โรพโทซิสในเซลล์ MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022) ดังนั้น จึงชี้ให้เห็นว่าการกำจัด PKCβII ด้วย CRISPR/Cas9 อาจเป็นเป้าหมายยีนยับยั้งเนื้องอกที่มีศักยภาพสำหรับการรักษาโรคที่เกี่ยวข้องกับเฟอร์โรพโทซิส (Zhang et al., 2022)
เชื่อกันว่าการดื้อยาเป็นสาเหตุของการเสียชีวิตในผู้ป่วยมะเร็งประมาณ 90% และเป็นหนึ่งในความท้าทายหลักในการรักษามะเร็ง (Bukowski et al., 2020) ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่ายีนจำนวนมากที่เกี่ยวข้องกับการขับยาออกจากเซลล์ การซ่อมแซม DNA การตายของเซลล์ และวิถีการส่งสัญญาณต่างๆ ของเซลล์มีความสัมพันธ์กับการดื้อยา (Haider et al., 2020) ในจำนวนนี้ ยีนหลายตัวได้รับการกำหนดเป้าหมายโดยเครื่องมือ CRISPR/Cas9 และแสดงให้เห็นผลลัพธ์ที่น่าสนใจในการลดการดื้อยาและเพิ่มประสิทธิภาพของการรักษามะเร็ง (Vaghari-Tabari et al., 2022) นอกจากนี้ ไลบรารีการคัดกรองยีนแบบ CRISPR/Cas9 ที่มีประสิทธิภาพสูงยังถูกนำมาใช้ในการปรับเปลี่ยนการทำงานของยีนเป้าหมายที่อาจดื้อยา (Shalem et al., 2015) เพื่อระบุยีนต้านทานแพคลิแท็กเซล ได้มีการใช้การจัดลำดับ RNA ร่วมกับการคัดกรองไลบรารี sgRNA ทั่วทั้งจีโนมเพื่อระบุยีนเป้าหมายแปดตัว รวมถึงฮิสโตนดีอะเซทิเลส 9 (HDAC9) ที่เกี่ยวข้องกับความต้านทานยาในผู้ป่วย TNBC ที่กลับมาเป็นซ้ำ (B et al., 2020) ในอีกการศึกษาหนึ่ง พบว่ามีการแสดงออกของไดเซอรีน/ทรีโอนีนและไทโรซีนโปรตีนไคเนส (DSTYK) เพิ่มขึ้นในระหว่างการอยู่รอดของผู้ป่วย TNBC ที่ได้รับการรักษาด้วยยาต้านมะเร็ง นอกจากนี้ การลดระดับ DSTYK ด้วย CRISPR/Cas9 ยังช่วยเพิ่มการตายของเซลล์มะเร็งที่ดื้อยาอย่างมีนัยสำคัญในหลอดทดลอง (เซลล์ SUM102PT และเซลล์ MDA-MB-468) และในแบบจำลอง TNBC ในร่างกาย (Ogbu et al., 2021)
แม้ว่า TNBC จะมีการทำงานที่ผิดปกติของวิถี MAPK แต่ผลทางคลินิกของการรักษาที่มุ่งเป้าไปที่ MEK นั้นไม่ดีนัก การคัดกรองไลบรารีจีโนมด้วย CRISPR/Cas9 เผยให้เห็นว่าการยับยั้ง PSMG2 (proteome assembly chaperone 2) ทำให้เซลล์ TNBC BT549 และ MB468 ไวต่อสารยับยั้ง MEK AZD6244 มากขึ้น การลดระดับ PSMG2 ด้วย CRISPR/Cas9 เปลี่ยนแปลงการทำงานของโปรตีเอโซมตามปกติ นำไปสู่การสลายตัวของ PDPK1 ผ่านกลไกออโตฟาจี ซึ่งช่วยปรับปรุงเซลล์มะเร็งในแบบจำลองหนูที่เป็น TNBC ที่เหนี่ยวนำโดย AZD6244 (สารยับยั้ง MEK) และ MG132 (สารยับยั้งโปรตีเอโซม) ดังนั้น สารยับยั้งโปรตีเอโซมและ MAP kinase (MEK) สามารถใช้ร่วมกันเพื่อลดการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็งได้ (Wang X. et al., 2022)
นอกจากนี้ CRISPR/Cas9 ยังถูกนำมาใช้ในการคัดกรองการสูญเสียการทำงานของยีนที่นำไปสู่การดื้อยาของ TNBC (Shu et al., 2020) Ge et al. ได้อธิบายกลไกการดื้อยาของเซลล์มะเร็งที่ได้รับการรักษาด้วย JQ1 ซึ่งเป็นสารยับยั้ง BET bromodomain (BBDI) ใน TNBC โดยใช้ CRISPR/Cas9 พวกเขาพบว่าการลบยีน rb1 ทำให้ TNBC ดื้อต่อยาต้านมะเร็ง JQ1 ดังนั้น การทำงานของ rb1 จึงมีความสำคัญต่อการตอบสนองต่อยา JQ1 ใน TNBC พวกเขายังรายงานว่าแพคลิแท็กเซลเป็นสารยับยั้ง CDK4/6 kinase/microtubule และการใช้ร่วมกับ BBDI เช่น JQ1 อาจให้ผลการรักษาที่น่าสนใจสำหรับ TNBC ที่ดื้อยา (Ge et al., 2020)
มีรายงานว่ารูปแบบการถอดรหัสของ RNA ที่ไม่เข้ารหัสแบบยาว (lncRNA) มีส่วนรับผิดชอบต่อการดื้อต่อการรักษาด้วยเคมีบำบัดก่อนการผ่าตัดในมะเร็งเต้านมชนิด TNBC งานวิจัยนี้แสดงให้เห็นว่า lncRNA ของ MALAT1 ที่แตกต่างกัน 5 ชนิดมีการแสดงออกในระดับสูงใน TNBC นอกจากนี้ การลบยีน MALAT1 ด้วย CRISPR/Cas9 ยังเพิ่มความไวของเซลล์ TNBC BT-549 ต่อแพคลิแท็กเซลและด็อกโซรูบิซิน ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทที่เป็นไปได้ของ MALAT1 ในการดื้อยาใน TNBC (Shaath et al., 2021)
การกลายพันธุ์ในยีน BRCA1 (BRCA1m) มีความหลากหลายและตรวจจับได้ยาก การกำหนดเป้าหมายไปที่ PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase) ซึ่งเป็นคู่หูสังเคราะห์ที่ทำให้เกิดการตายร่วมกับ BRCA1 อาจเพิ่มความไวต่อยาเคมีบำบัดในมะเร็งเต้านมชนิด TNBC การใช้ CRISPR/Cas9 ในการลบ PARP1 ทำให้ความไวของยาต้านมะเร็ง เช่น doxorubicin, gemcitabine และ docetaxel เพิ่มขึ้นในเซลล์มะเร็งเต้านมชนิด TNBC ที่มีการกลายพันธุ์ mBRCA1 ซึ่งบ่งชี้ว่า PARP1 มีส่วนเกี่ยวข้องกับความต้านทานยาในมะเร็งเต้านมชนิด TNBC ด้วย (Vaghari-Tabari et al., 2022) การกลายพันธุ์ในยีนยับยั้งเนื้องอก BRCA1 หรือ BRCA2 เป็นที่ทราบกันดีว่าเพิ่มโอกาสในการเกิดมะเร็งเต้านมในคน การรักษาผู้ป่วยเหล่านี้จำเป็นต้องใช้สารยับยั้ง PARP นอกจากนี้ ยังมีการแสดงให้เห็นว่าการกำจัดปัจจัยการกู้คืนนิวคลีโอไทด์ DNPH1 โดยใช้ CRISPR/Cas9 สามารถกำจัดนิวคลีโอไทด์ที่เป็นพิษ 5-ไฮดรอกซีเมทิลดีออกซีอูริดีน (hmdU) โมโนฟอสเฟต ซึ่งจะช่วยเพิ่มการตอบสนองของเซลล์ที่ขาด BRCA ต่อสารยับยั้ง PARP (Fugger และคณะ, 2021) ดังนั้น CRISPR/Cas9 และสารยับยั้ง PARP1 อาจกลายเป็นกลยุทธ์การรักษาที่สำคัญสำหรับ TNBC
ยีนเพเนทรานต์ไกลโคโปรตีน (P-gp) เป็นยีนต้านทานยาหลายชนิดที่มักมีการแสดงออกเพิ่มขึ้นในมะเร็งเต้านมชนิด TNBC ประมาณ 41% (Sun et al., 2020) การขับยาออกจากเซลล์ที่เกิดจาก P-gp ได้รับการระบุว่าเป็นกลไกสำคัญในการควบคุมการดื้อยาในมะเร็งเต้านม สารยับยั้ง P-gp แสดงให้เห็นถึงความไวต่อยาต้านมะเร็งที่เพิ่มขึ้นในมะเร็งเต้านม (Famta et al., 2021) ดังนั้น การทำลายหรือยับยั้ง P-gp ด้วย CRISPR/Cas9 และสารยับยั้ง P-gp อาจเป็นวิธีการที่สำคัญมากในการเอาชนะการดื้อยาในมะเร็งเต้านมชนิด TNBC
เป็นที่ทราบกันดีว่าโปรตีนขนส่งแคสเซ็ตที่จับกับ ATP ชนิด G2 (ABCG2) ทำให้เกิดการดื้อยาในมะเร็งเต้านมชนิด TNBC (Palasuberniam et al., 2015) แม้ว่าในปัจจุบันจะยังไม่มีรายงานเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่าง CRISPR/Cas9 และการยับยั้งการทำงานของ ABCG2 รวมถึงการปิดใช้งานยีนยับยั้งเนื้องอกก็ตาม PTEN อาจช่วยเพิ่มการทำงานของ ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021) ดังนั้น การใช้ CRISPR/Cas9 เพื่อกำจัด ABCG2 และการรวมเข้ากับสารยับยั้ง ABCG2 อาจเป็นวิธีการรักษาที่เหมาะสมในการเอาชนะการดื้อยาในมะเร็งเต้านมชนิด TNBC ตารางที่ 2 กล่าวถึง CRISPR/Cas9 ที่กำหนดเป้าหมายไปยังยีนที่ดื้อยาทั้งหมด
ตารางที่ 2. CRISPR/Cas9 กำหนดเป้าหมายยีนต้านทาน TNBC ต่างๆ เพื่อเพิ่มความไวของเซลล์ต่อยาต้านมะเร็ง
ไลบรารี CRISPR/Cas9 เป็นเครื่องมือที่มีศักยภาพในการคัดกรองการกลายพันธุ์ของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรคมะเร็ง (Chan et al., 2022) วิธีการคัดกรองนี้ประกอบด้วยสี่ขั้นตอน ได้แก่ (ก) การสร้างไลบรารี (ข) การถ่ายทอดไวรัสเลนติ (ค) การคัดกรองฟีโนไทป์ และ (ง) การวิเคราะห์ยีนเป้าหมาย แม้ว่า TNBC จะมีการกระตุ้นวิถี MAPK ที่ผิดปกติ แต่การพยากรณ์โรคทางคลินิกของการบำบัดแบบมุ่งเป้าไปที่ MEK สำหรับผู้ป่วย TNBC ที่มีการกลายพันธุ์ในยีนยับยั้งเนื้องอก เช่น PTEN, RB1 และ TP53 นั้นแย่มาก
นอกจากนี้ การคัดกรองยีนโดยใช้ CRISPR/Cas9 ได้ทดสอบโมเลกุลที่มีศักยภาพและมีความจำเพาะสูงที่สุด คือ ดีไฮโดรคาโทรล ซึ่งมีอยู่มากมายในสารสกัดจากดอกและใบของกัวเตมาลา เพื่อทำความเข้าใจผลกระทบของดีไฮโดรคาโทรลต่อกลไกการทำลายเซลล์แบบจำเพาะของ MDA-MB-231 และลักษณะเฉพาะของเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคม์ของมะเร็งเต้านมชนิด TNBC การคัดกรองโดยใช้ CRISPR/Cas9 นี้ยังเผยให้เห็นว่า HSD17B11 ซึ่งเป็นยีนที่เข้ารหัส 17β-ไฮดรอกซีสเตียรอยด์ดีไฮโดรจีเนสชนิดที่ 11 มีการแสดงออกสูงในเซลล์ MDA-MB-231 และส่งผลให้เกิดดีไฮโดรฟัลคารินอลที่มีความจำเพาะต่อเซลล์ MDA-MB-231 (Grant et al., 2020) ดังนั้น สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการคัดกรองจีโนมด้วย CRISPR/Cas9 มีศักยภาพสูงในการระบุกลไกที่อยู่เบื้องหลังคุณสมบัติต้านมะเร็งของสารประกอบธรรมชาติที่มีศักยภาพ
นอกจากนี้ ยังมีการศึกษาความเปราะบางของ TNBC ต่อการเกิดมะเร็งโดยใช้การคัดกรอง CRISPR/Cas9 ในร่างกายแบบไม่ลำเอียงทั่วทั้งจีโนม ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความเชื่อมโยงระหว่างวิถีทางที่ก่อให้เกิดมะเร็งและวิถีทางยับยั้งเนื้องอก ส่วนประกอบสำคัญของวิถีทาง mTOR และ Hippo ได้รับการรายงานว่ามีบทบาทสำคัญในการควบคุมเนื้องอกใน TNBC นอกจากนี้ การศึกษายังแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งทางเภสัชวิทยาของโปรตีนออนโคเจน mTORC1/2 และ YAP สามารถยับยั้งการก่อโรคของ TNBC ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยใช้แบบจำลองการทำงานร่วมกันของยาและเมทริกซ์ในหลอดทดลองและการปลูกถ่ายเนื้อเยื่อจากผู้ป่วยในร่างกาย ยิ่งไปกว่านั้น การยับยั้ง mTORC1/2 ที่เกิดจาก Torin-1 ช่วยเพิ่ม macropinocytosis ในขณะที่การยับยั้ง YAP ที่เกิดจาก verteporfin นำไปสู่การตายของเซลล์ TNBC โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้เน้นย้ำถึงพลังและความแข็งแกร่งของการคัดกรอง CRISPR ในร่างกายทั่วทั้งจีโนมเพื่อระบุวิธีการรักษาใหม่และมีประสิทธิภาพสำหรับ TNBC (Dai et al., 2021)
การทำงานที่ผิดปกติของระบบภูมิคุ้มกันเป็นปัจจัยสำคัญในการเกิดเนื้องอก เซลล์มะเร็งหลีกเลี่ยงการกำจัดโดยระบบภูมิคุ้มกันโดยการข้ามกลไกการป้องกัน รวมถึงการรบกวนการทำงานของเซลล์ภูมิคุ้มกันในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกและการทำลายระบบภูมิคุ้มกัน ดังนั้น การพัฒนาระบบภูมิคุ้มกันที่ดีขึ้นอาจเป็นแนวทางสำคัญในการต่อสู้กับเนื้องอก การใช้การดัดแปลงยีนด้วย CRISPR/Cas9 ช่วยแก้ไขปัญหาหลายประการที่เกี่ยวข้องกับการทำงานที่ผิดปกติของระบบภูมิคุ้มกันจากมุมมองที่แตกต่างกัน CRISPR/Cas9 ถูกนำมาใช้เพื่อปรับปรุงภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกในมะเร็งเต้านมผ่านทางเส้นทางต่อไปนี้ (รูปที่ 3)
รูปที่ 3 การบำบัดด้วยภูมิคุ้มกัน CRISPR/Cas9 มุ่งเป้าไปที่เซลล์ TNBC การสูญเสีย CDK5 และการลดระดับ PDL1 และ CD155 ช่วยเสริมสร้างระบบภูมิคุ้มกัน ในทำนองเดียวกัน การสูญเสีย A2AR และการลดระดับ TAA เช่น HER2, mucin 1 และ TEM8 เพิ่มประสิทธิภาพของเซลล์ CAR-T ในการฆ่าเซลล์มะเร็ง การคัดกรองเซลล์ T ที่ขับเคลื่อนด้วย CRISPR/Cas9 แสดงให้เห็นว่าการรบกวนของ p38 kinase ช่วยเพิ่มกิจกรรมต้านมะเร็งของเซลล์ T เซลล์ T ที่ได้รับการดัดแปลงโดย CRISPR/Cas9 เพิ่มการแสดงออกของ TCR (ตัวรับเซลล์ T) ส่งผลให้เซลล์ T มีกิจกรรมต้านมะเร็ง
เป้าหมายของการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันบำบัดคือการกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันให้โจมตีเซลล์มะเร็ง การแสดงออกมากเกินไปของโปรตีนควบคุมจุดตรวจสอบภูมิคุ้มกันมักจะป้องกันปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันทำลายตนเอง แต่ก็อาจช่วยให้มะเร็งหลีกเลี่ยงปฏิกิริยาเหล่านั้นได้ (Topalian et al., 2015) โปรตีนเหล่านี้ป้องกันปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันโดยการจับกับตัวรับบนพื้นผิวของเซลล์ภูมิคุ้มกัน โปรตีนควบคุมจุดตรวจสอบหลายชนิด (เช่น CD155 และ PD-L1) กำหนดเป้าหมายที่ตัวรับ PD-1 บนเซลล์ภูมิคุ้มกันและมีการแสดงออกในมะเร็งเต้านม โดยเฉพาะอย่างยิ่ง TNBC (Li Y.-C. et al., 2020) การลดระดับ PD-L1 หรือตัวรับของมันโดยใช้ CRISPR/Cas9 สามารถกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันให้โจมตีเนื้องอก TNBC ได้ (Yahata et al., 2019) นอกจากนี้ การลดระดับการแสดงออกของ PD-L1 ผ่านการลบ CDK5 โดยใช้ CRISPR/Cas9 ได้แสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเนื้องอกในหลอดทดลองและในร่างกายได้ (Deng et al., 2020) การยับยั้งการเจริญเติบโตในแบบจำลองมะเร็งเต้านมทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย บ่งชี้ว่าการลดระดับ CD155 โดยใช้ shRNA อาจมีผลในการรักษาโรคมะเร็งเต้านม (Gao et al., 2018)
เซลล์ CAR T แสดงออกถึง CAR ที่จดจำแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก (TAA) และสามารถใช้การลดระดับโปรตีนควบคุมภูมิคุ้มกันเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการทำงาน (Li C. et al., 2020) มีเป้าหมายที่เป็นไปได้หลายอย่างสำหรับการบำบัดด้วยเซลล์ CAR T ในมะเร็งเต้านม รวมถึง TAA หลายชนิด เช่น HER2, mucin1 และ TEM8 (Bajgain et al., 2018) มีหลักฐานว่าเซลล์ CAR T ที่กำหนดเป้าหมายไปที่ mesothelin (ซึ่งมีการแสดงออกมากเกินไปในเซลล์ TNBC BT-459) มีประสิทธิภาพในการต่อต้านมะเร็งมากขึ้นเมื่อ PD-1 ถูกกำจัดออกไปโดยใช้ CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019) อย่างไรก็ตาม การแยกเซลล์ T จากผู้ป่วยแล้วทำการแก้ไขเซลล์เหล่านั้นภายนอกร่างกายเป็นกระบวนการที่ต้องใช้แรงงานมากและใช้เวลานาน แม้ว่าเซลล์ T สากลจะช่วยลดความต้องการในการแยกเซลล์ได้ แต่เซลล์ T จากผู้บริจาคที่แสดงออกถึงแอนติเจนเม็ดเลือดขาวของมนุษย์ (HLA) คลาส I และตัวรับเซลล์ T (TCR) ควรถูกกำจัดออกไปเพื่อป้องกันความผิดปกติของการปลูกถ่ายต่อต้านโฮสต์ (Ren et al., 2017, 2017a) การใช้ CRISPR/Cas9 ใน HDR สามารถกำจัด TCR และ HLA พร้อมกันได้ และยังสามารถกำจัดยีนที่เข้ารหัส CAR ได้ด้วย การศึกษาต่างๆ แสดงให้เห็นว่า CRISPR/Cas9 สามารถใช้เพื่อนำ CAR ต่อต้าน CD19 เข้าสู่ตำแหน่ง TCR ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ทำให้สามารถสร้าง CAR ได้โดยไม่ต้องกำจัดเซลล์ T (Dimitri et al., 2022) เทคโนโลยีมัลติเพล็กซ์ได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อสร้างเซลล์ T CAR จากผู้บริจาคต่างสายพันธุ์ โดยการกำจัด TCR, เบต้า-2-ไมโครโกลบูลิน (B2M), หน่วยย่อย HLA-I และโปรตีนอื่นๆ เช่น PD-1 และ CTLA-4 พร้อมกันได้ ซึ่งอาจมีคุณสมบัติในการต่อต้านมะเร็งที่ดีกว่า กับ TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022)
การใช้ CRISPR/Cas9 อาจช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของเซลล์ CAR-T ได้ อะดีโนซีนเป็นที่ทราบกันดีว่ามีคุณสมบัติในการกดภูมิคุ้มกันและสามารถลดภูมิคุ้มกันต้านมะเร็งได้โดยการปิดกั้นการทำงานของเซลล์ T และกระตุ้นตัวรับอะดีโนซีน A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019) การปิดกั้น A2AR โดยใช้ CRISPR/Cas9 ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของเซลล์ CAR-T ในร่างกายได้อย่างมีนัยสำคัญ (Giuffrida et al., 2021) เซลล์ T เป็นที่ทราบกันดีว่าแสดงลักษณะทางฟีโนไทป์ที่หลากหลาย เช่น การขยายตัวของเซลล์ การแบ่งตัว ความเครียดจากออกซิเดชัน และความเครียดทางพันธุกรรม การคัดกรองเซลล์ T โดยใช้ CRISPR/Cas9 เผยให้เห็นการหยุดชะงักของไคเนสตัวรับเซลล์ T ที่แตกต่างกัน 25 ชนิด ในบรรดาปัจจัยเหล่านั้น การลบยีน p38 kinase แสดงให้เห็นว่าช่วยเพิ่มฤทธิ์ต้านมะเร็งของเซลล์ T ซึ่งบ่งชี้ว่า p38 kinase เป็นตัวควบคุมหลักของการควบคุมเซลล์ CAR-T (Gurusamy et al., 2020)
เซลล์ T สามารถถูกดัดแปลงทางพันธุกรรมได้โดยใช้ CRISPR/Cas9 เพื่อสร้าง TCR ที่แสดงออกในระดับสูง การถ่ายโอนเซลล์ T ที่ถูกดัดแปลงทางพันธุกรรมไปยังผู้ป่วยแสดงให้เห็นถึงฤทธิ์ต้านมะเร็งที่แข็งแกร่งกว่าเซลล์ T ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ ดังนั้น TCR ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติอาจแข่งขันกับ TCR ที่ถูกดัดแปลงทางพันธุกรรมในผู้ป่วย ซึ่งอาจส่งผลกระทบต่อศักยภาพของการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันบำบัดมะเร็ง เพื่อเอาชนะปัญหานี้ การใช้ CRISPR/Cas9 เพื่อกำจัด TCR-β ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติในเซลล์ผู้รับ และจากนั้นถ่ายโอนเซลล์ T ที่มี TCR-β ไปยังผู้ป่วยมะเร็ง อาจแสดงให้เห็นถึงการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต้านมะเร็งที่ดีกว่าโดยไม่จำเป็นต้องมีการแข่งขันทางเพศของ TCR ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ (Fan et al. 2018) ดังนั้น ยกเว้นเซลล์ T ที่ถูกดัดแปลงด้วย CRISPR แล้ว TCR จึงมีความไวต่อแอนติเจนของเนื้องอกมากกว่าเซลล์ T ที่ถูกถ่ายทอด TCR ปกติถึงพันเท่า นอกจากนี้ ในมะเร็งเม็ดเลือดขาวหลายชนิด เซลล์ T ที่เปลี่ยนแปลงไปซึ่งสร้างขึ้นโดย γδ TCR+ CRISPR แสดงการแสดงออกของเซลล์ T ชนิด CD4+ และ CD8+ ที่สูงกว่าการถ่ายโอน TCR มาตรฐาน (Legut et al., 2018) ดังนั้น เซลล์ T ที่ได้รับการดัดแปลงซึ่งสร้างขึ้นโดย CRISPR/Cas9 อาจเป็นวิธีการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันบำบัดที่มีประสิทธิภาพในการเอาชนะมะเร็งเต้านมชนิด TNBC
อินทิกรินเป็นโมเลกุลการยึดเกาะของเซลล์ที่พบในเยื่อหุ้มเซลล์และส่งเสริมการยึดเกาะของเซลล์กับเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) (Hamidi และ Ivaska, 2018) การทำงานที่ผิดปกติของอินทิกรินเกี่ยวข้องกับการพัฒนาและการแพร่กระจายของมะเร็งโดยการเปลี่ยนแปลงเมทริกซ์นอกเซลล์ ซึ่งนำไปสู่การอยู่รอดของเซลล์มะเร็งในกระแสเลือด (Hamidi และ Ivaska, 2018) การลดระดับอินทิกรินด้วย CRISPR/Cas9 ช่วยชะลอการลุกลาม การแพร่กระจาย และการตั้งรกรากของเนื้องอกใน TNBC การลดระดับอินทิกริน a5 (ITGA5) มีรายงานว่าช่วยลดการเคลื่อนที่และการลุกลามของเซลล์ในมะเร็งชนิดอื่น เช่น มะเร็งปอด (Ju et al., 2017) ซึ่งบ่งชี้ว่าอินทิกริน a5 อาจเป็นปัจจัยสำคัญในการเกิดโรคของ TNBC ด้วยเช่นกัน
การสร้างหนูที่ยีนถูกปิดใช้งานโดยใช้วิธีเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน (ES) แบบดั้งเดิมนั้นเป็นกระบวนการที่ต้องใช้แรงงานมาก ใช้เวลานาน และไม่มีประสิทธิภาพ ต้องใช้เวลาหลายเดือนหรือหลายปีในการกำหนดเป้าหมายเซลล์ ES ผ่านการรวมตัวกันของโครโมโซมที่เหมือนกัน ผสมพันธุ์หนูไคเมอริก แล้วนำไปผสมกับหนูเฮเทอโรไซกัสเพื่อผลิตลูกหลานโฮโมไซกัส การผสมข้ามพันธุ์ที่ซับซ้อนเป็นสิ่งจำเป็นในการสร้างหนูที่มีการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมหลายตำแหน่ง อย่างไรก็ตาม ปัญหาหลายอย่างเกิดขึ้นเมื่อใช้หนูที่สร้างขึ้นโดยการทำลายเซลล์ ES โดยใช้ CRISPR/Cas9 หรือโดยการฉีดส่วนประกอบ CRISPR/Cas9 เข้าไปในไข่ที่ได้รับการปฏิสนธิแบบเซลล์เดียว ตัวอย่างเช่น การเปลี่ยนแปลงมักเกิดขึ้นที่ตำแหน่งไบอัลลีลิกและไม่จำเพาะเจาะจงกับยีนใด ยีนหนึ่ง มีรายงานเมื่อเร็วๆ นี้ว่าเซลล์ ES ที่ใช้เทคโนโลยี CRISPR/Cas9 สามารถแทรกการกลายพันธุ์แบบไบอัลลีลิกพร้อมกันได้ถึง 5 ยีน (Nishizono et al., 2021) เพื่อจุดประสงค์นี้ mRNA ของ Cas9 และ gRNA ที่จำเพาะเจาะจงกับยีนทั้งห้าตัวถูกถ่ายโอนเข้าไปในเซลล์ ES พร้อมกัน สิ่งนี้เน้นย้ำถึงศักยภาพและประสิทธิภาพของกระบวนการนี้ แม้ว่าการกลายพันธุ์เหล่านี้อาจถูกส่งต่อเมื่อมีการผสมพันธุ์สายพันธุ์เริ่มต้นเพื่อสร้างหนูที่มียีนถูกตัดออกห้าตำแหน่ง งานวิจัยนี้ยังรายงานการค้นพบที่น่าประหลาดใจอีกด้วย นั่นคือ ไม่จำเป็นต้องใช้เซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน (ES cells) อีกต่อไปในการสร้างหนูที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรม แต่ใช้วิธีฉีด mRNA และ gRNA ของ Cas9 เข้าไปในตัวอ่อนระยะเซลล์เดียวเพื่อกำจัดผลิตภัณฑ์ของยีนที่เฉพาะเจาะจง ส่งผลให้ได้สร้างสายพันธุ์เริ่มต้นที่มียีนถูกตัดออก ซึ่งในทางทฤษฎีแล้วสามารถนำมาใช้ศึกษาผลที่ตามมาจากการลบยีนในหนูได้ (Qin et al., 2016) ดังนั้น CRISPR/Cas9 จึงช่วยให้สามารถสร้างหนูแปลงพันธุกรรมเพื่อรักษา TNBC ได้ในราคาที่ต่ำกว่าวิศวกรรมพันธุกรรมแบบดั้งเดิม โดยใช้ระบบ CRISPR/Cas ได้มีการพัฒนารูปแบบหนูที่มียีนถูกตัดออกแบบใหม่ที่สามารถนำการกลายพันธุ์แบบจุดในยีนภายในหนึ่งยีนหรือมากกว่าใน TNBC ได้สำเร็จ จากแนวคิดนี้ ยังสามารถพัฒนาแบบจำลองสัตว์ของ TNBC ได้โดยใช้การลบยีน BRCA1 และ p53 ด้วย CRISPR/Cas9 ซึ่งส่งผลให้สูญเสียการซ่อมแซม HR เกิดความไม่เสถียรของจีโนม และเกิดฟีโนไทป์กลายพันธุ์ (Annunziato et al., 2020)
ปัจจุบัน มีวิธีการต่างๆ เช่น แมมโมแกรม การถ่ายภาพด้วยคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า (MRI) และอัลตราซาวนด์ ที่ใช้ในการวินิจฉัย TNBC อย่างไรก็ตาม วิธีการเหล่านี้มีข้อจำกัดบางประการ แมมโมแกรมใช้ในการวินิจฉัยเนื้อเยื่อเต้านมเฉพาะที่มากกว่าการแพร่กระจาย ซึ่งเซลล์มะเร็งได้เคลื่อนย้ายไปยังอวัยวะอื่นๆ อัลตราซาวนด์ไม่ใช่วิธีการที่เชื่อถือได้ในการวินิจฉัย TNBC (Chen และ Lee-Felker, 2023) MRI มีความไวสูงกว่าอัลตราซาวนด์และแมมโมแกรม แต่ความแม่นยำในการวินิจฉัยมีจำกัด (Sha และ Chen, 2022) การตัดชิ้นเนื้อเพื่อตรวจวินิจฉัยเป็นวิธีที่รุกราน แต่ในบางกรณี การตัดชิ้นเนื้ออาจพลาดเนื้อเยื่อมะเร็งหากเข็มเบี่ยงเบนออกจากบริเวณที่ต้องการ นอกจากนี้ยังมีค่าใช้จ่ายสูงและอาจทำให้ผู้ป่วยรู้สึกเจ็บปวดได้ TNBC เป็นมะเร็งชนิดที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน ดังนั้นการตัดชิ้นเนื้ออาจไม่ให้ข้อมูลที่เพียงพอเกี่ยวกับชนิดของมะเร็ง ด้วยเหตุนี้ จึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องมีวิธีการวินิจฉัยใหม่ที่น่าเชื่อถือสำหรับการตรวจหา TNBC ระบบ CRISPR/Cas9 อาจเป็นทางเลือกที่มีความไวสูงและรุกรานน้อยที่สุดสำหรับการวินิจฉัยมะเร็งเต้านม โดยกลยุทธ์ที่ใช้ CRISPR/Cas9 สามารถนำมาใช้ปรับปรุงวิธีการ PCR สำหรับการวินิจฉัย TNBC ได้ ขั้นแรก โปรตีน Cas9 และ cpf1 ของระบบ CRISPR จะถูกใช้เพื่อกำจัด DNA ที่ไม่จำเพาะ จากนั้นโปรตีนทั้งสองนี้ (Cas9 และ cpf1) จะจดจำลำดับ PAM ก่อนที่จะจับกับ DNA เป้าหมาย (Deepak Singh et al., 2021) ดังนั้น PCR จึงสามารถระบุการกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาของมะเร็งได้ มีการศึกษาหลายชิ้นที่ใช้กลยุทธ์ที่ใช้ CRISPR นี้เพื่อตรวจจับการกลายพันธุ์ที่แตกต่างกันในมะเร็งชนิดต่างๆ (Safari et al., 2019) ดังนั้น วิธีการ PCR ที่ใช้ CRISPR อาจช่วยลดการพึ่งพาการวินิจฉัย TNBC ด้วยวิธีการที่รุกราน เช่น การตรวจทางภูมิคุ้มกันวิทยาจากชิ้นเนื้อ
การเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมในการควบคุมตัวรับฮอร์โมนได้รับการพิสูจน์แล้วในมะเร็งเต้านมชนิด TNBC (Chen และ Russo, 2009) กลยุทธ์ PCR ที่ใช้ CRISPR/Cas9 โดยใช้ไมโครอาร์เรย์สำหรับการวินิจฉัย ณ จุดดูแลผู้ป่วย สามารถตรวจสอบการกลายพันธุ์เหล่านี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพ (Hajian et al., 2019) นอกจากนี้ยังสามารถให้ข้อมูลที่เกี่ยวข้องเกี่ยวกับการกลายพันธุ์เฉพาะในผู้ป่วย TNBC แก่ผู้ให้บริการด้านสุขภาพ ซึ่งจะช่วยปรับปรุงแนวทางการรักษาได้ อย่างไรก็ตาม เทคนิคแบบผสมผสานนี้มีข้อจำกัด ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการวิจัยอย่างกว้างขวางก่อนที่วิธีการ CRISPR/Cas-PCR นี้จะสามารถนำมาใช้ในด้านการดูแลสุขภาพสำหรับการวินิจฉัย TNBC (Yang et al., 2019)
วันที่เผยแพร่: 14 ตุลาคม 2567