เมตาโบโลมิกส์ที่แยกแยะก้อนเนื้อในปอดที่เป็นพิษเป็นภัยและเนื้องอกในปอดที่มีความจำเพาะสูงโดยใช้การวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมตริกความละเอียดสูงของซีรั่มของผู้ป่วย

การวินิจฉัยแยกโรคของก้อนเนื้อในปอดที่ระบุโดยเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ (CT) ยังคงเป็นความท้าทายในการปฏิบัติงานทางคลินิกที่นี่ เราแสดงลักษณะเฉพาะของเมตาโบโลมทั่วโลกของตัวอย่างซีรั่ม 480 ตัวอย่าง รวมถึงการควบคุมสุขภาพที่ดี ก้อนเนื้อในปอดที่ไม่เป็นอันตราย และมะเร็งของต่อมในปอดระยะที่ 1มะเร็งของต่อมแสดงโปรไฟล์การเผาผลาญที่เป็นเอกลักษณ์ ในขณะที่ก้อนที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยและบุคคลที่มีสุขภาพดีมีความคล้ายคลึงกันสูงในรูปแบบการเผาผลาญในกลุ่มการค้นพบ (n = 306) มีการระบุชุดของสารเมตาบอไลต์ 27 ชนิดเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างก้อนเนื้อที่ไม่ร้ายแรงและก้อนเนื้อร้ายAUC ของแบบจำลองจำแนกในกลุ่มการตรวจสอบภายใน (n = 104) และการตรวจสอบภายนอก (n = 111) เท่ากับ 0.915 และ 0.945 ตามลำดับการวิเคราะห์วิถีทางเผยให้เห็นการเพิ่มขึ้นของสารไกลโคไลติกที่เกี่ยวข้องกับทริปโตเฟนที่ลดลงในซีรัมมะเร็งของต่อมในปอดเมื่อเปรียบเทียบกับก้อนเนื้อที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยและกลุ่มควบคุมที่ดีต่อสุขภาพ และแนะนำว่าการดูดซึมทริปโตเฟนส่งเสริมไกลโคไลซิสในเซลล์มะเร็งปอดการศึกษาของเราเน้นถึงคุณค่าของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของสารเมตาบอไลต์ในซีรั่มในการประเมินความเสี่ยงของก้อนเนื้อในปอดที่ตรวจพบโดย CT
การวินิจฉัยตั้งแต่เนิ่นๆ มีความสำคัญอย่างยิ่งในการปรับปรุงอัตราการรอดชีวิตของผู้ป่วยโรคมะเร็งผลลัพธ์จากการทดลองคัดกรองมะเร็งปอดแห่งชาติของสหรัฐอเมริกา (NLST) และการศึกษาของ NELSON ของยุโรป แสดงให้เห็นว่าการตรวจคัดกรองด้วยเครื่องเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ขนาดต่ำ (LDCT) สามารถลดการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งปอดในกลุ่มที่มีความเสี่ยงสูงได้อย่างมีนัยสำคัญ1,2,3นับตั้งแต่มีการใช้ LDCT อย่างแพร่หลายในการตรวจคัดกรองมะเร็งปอด อุบัติการณ์ของการค้นพบด้วยภาพเอ็กซ์เรย์โดยบังเอิญของก้อนในปอดที่ไม่มีอาการยังคงเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง 4ก้อนในปอดหมายถึงความทึบโฟกัสที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางไม่เกิน 3 ซม. 5เราเผชิญกับความยากลำบากในการประเมินความน่าจะเป็นของมะเร็งและการรับมือกับก้อนเนื้อในปอดจำนวนมากที่ตรวจพบโดยบังเอิญบน LDCTข้อจำกัดของ CT สามารถนำไปสู่การตรวจติดตามผลบ่อยครั้งและผลบวกลวง นำไปสู่การแทรกแซงที่ไม่จำเป็นและการรักษามากเกินไป6ดังนั้นจึงจำเป็นต้องพัฒนาตัวชี้วัดทางชีวภาพที่เชื่อถือได้และมีประโยชน์เพื่อระบุมะเร็งปอดอย่างถูกต้องในระยะแรก และแยกแยะก้อนเนื้อที่ไม่ร้ายแรงส่วนใหญ่ในการตรวจพบครั้งแรก 7
การวิเคราะห์ระดับโมเลกุลที่ครอบคลุมของเลือด (ซีรั่ม พลาสมา เซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดส่วนปลาย) รวมถึงจีโนมิกส์ โปรตีโอมิกส์ หรือ DNA methylation8,9,10 ได้นำไปสู่ความสนใจที่เพิ่มขึ้นในการค้นพบตัวชี้วัดทางชีวภาพสำหรับการวินิจฉัยโรคมะเร็งปอดในขณะเดียวกัน วิธีเมแทบอลิซึมจะวัดผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายระดับเซลล์ที่ได้รับอิทธิพลจากการกระทำภายนอกและภายนอก ดังนั้นจึงนำไปใช้ในการทำนายการโจมตีและผลลัพธ์ของโรคโครมาโตกราฟีของเหลว-มวลสเปกโตรมิเตอร์แบบตีคู่ (LC-MS) เป็นวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการศึกษาเมแทบอลิกเนื่องจากมีความไวสูงและช่วงไดนามิกขนาดใหญ่ ซึ่งสามารถครอบคลุมสารที่มีคุณสมบัติทางเคมีกายภาพที่แตกต่างกัน11,12,13แม้ว่าการวิเคราะห์เมแทบอลิซึมทั่วโลกของพลาสมา/ซีรั่มจะถูกนำมาใช้เพื่อระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องกับการวินิจฉัยโรคมะเร็งปอด และประสิทธิภาพการรักษา แต่ตัวแยกประเภทเมตาโบไลต์ในซีรั่ม 18 ตัวเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างก้อนเนื้อในปอดที่เป็นพิษเป็นภัยและมะเร็งยังคงต้องได้รับการศึกษาอย่างมาก- การวิจัยขนาดใหญ่
มะเร็งของต่อมและมะเร็งเซลล์สความัสเป็นสองชนิดย่อยหลักของมะเร็งปอดชนิดไม่เล็ก (NSCLC)การตรวจคัดกรอง CT ต่างๆ บ่งชี้ว่ามะเร็งของต่อมเป็นมะเร็งปอดประเภทเนื้อเยื่อวิทยาที่พบบ่อยที่สุด1,19,20,21ในการศึกษานี้ เราใช้โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงเป็นพิเศษ - แมสสเปกโตรเมทรีที่มีความละเอียดสูง (UPLC-HRMS) เพื่อทำการวิเคราะห์เมตาโบโลมิกส์ในตัวอย่างซีรั่มทั้งหมด 695 ตัวอย่าง รวมถึงกลุ่มควบคุมที่ดีต่อสุขภาพ ก้อนเนื้อในปอดที่ไม่ร้ายแรง และตรวจพบ CT ที่ขนาด ≤3 ซม.การตรวจคัดกรองมะเร็งปอดระยะที่ 1เราระบุแผงของสารในซีรั่มที่แยกแยะมะเร็งของต่อมในปอดจากก้อนที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยและการควบคุมที่ดีต่อสุขภาพการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะของวิถีทางเผยให้เห็นว่าทริปโตเฟนและเมตาบอลิซึมของกลูโคสที่ผิดปกติเป็นการเปลี่ยนแปลงทั่วไปในมะเร็งของต่อมในปอดเมื่อเปรียบเทียบกับก้อนที่ไม่ร้ายแรงและการควบคุมที่ดีต่อสุขภาพในที่สุด เราได้สร้างและตรวจสอบความถูกต้องของตัวจำแนกประเภทการเผาผลาญในซีรั่มที่มีความจำเพาะและความไวสูงเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างก้อนเนื้อในปอดที่เป็นมะเร็งและก้อนเนื้อร้ายที่ตรวจพบโดย LDCT ซึ่งอาจช่วยในการวินิจฉัยแยกโรคตั้งแต่เนิ่นๆ และการประเมินความเสี่ยง
ในการศึกษาปัจจุบัน ตัวอย่างซีรั่มที่จับคู่เพศและอายุได้รับการเก็บย้อนหลังจากกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี 174 ราย ผู้ป่วย 292 รายที่มีก้อนเนื้อในปอดที่ไม่ร้ายแรง และผู้ป่วย 229 รายที่เป็นมะเร็งปอดระยะที่ 1ลักษณะทางประชากรของอาสาสมัคร 695 คนแสดงอยู่ในตารางเสริม 1
ดังที่แสดงในรูปที่ 1a ตัวอย่างซีรั่มทั้งหมด 480 ตัวอย่างรวมถึงการควบคุมสุขภาพ (HC) 174 รายการ, ก้อนเนื้องอกที่ไม่เป็นพิษเป็นภัย (BN) 170 ชิ้นและตัวอย่างมะเร็งต่อมน้ำเหลืองในปอด (LA) 136 ตัวอย่างถูกรวบรวมที่ศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็นกลุ่มการค้นพบสำหรับการทำโปรไฟล์เมตาโบโลมิกที่ไม่ตรงเป้าหมายโดยใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ-แมสสเปกโตรเมตรีความละเอียดสูง (UPLC-HRMS)ดังที่แสดงในรูปที่ 1 เพิ่มเติม มีการระบุสารที่แตกต่างระหว่าง LA และ HC, LA และ BN เพื่อสร้างแบบจำลองการจำแนกประเภทและสำรวจการวิเคราะห์เส้นทางที่แตกต่างเพิ่มเติมตัวอย่าง 104 ตัวอย่างที่เก็บโดยศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็น และตัวอย่าง 111 ตัวอย่างที่เก็บโดยโรงพยาบาลอีกสองแห่งจะต้องได้รับการตรวจสอบความถูกต้องทั้งภายในและภายนอกตามลำดับ
การศึกษาประชากรในกลุ่มการค้นพบที่ได้รับการวิเคราะห์เมแทบอลิซึมของซีรั่มทั่วโลกโดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ-แมสสเปกโตรมิเตอร์ความละเอียดสูง (UPLC-HRMS)b การวิเคราะห์จำแนกกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน (PLS-DA) ของเมตาโบโลมทั้งหมดของตัวอย่างซีรั่ม 480 ตัวอย่างจากกลุ่มการศึกษา รวมถึงการควบคุมสุขภาพที่ดี (HC, n = 174), ก้อนที่ไม่เป็นพิษเป็นภัย (BN, n = 170) และมะเร็งของต่อมในปอดระยะที่ 1 (ลอสแอนเจลิส n = 136)+ESI, โหมดอิออไนเซชันด้วยอิเล็กโทรสเปรย์เชิงบวก, -ESI, โหมดอิออไนเซชันด้วยอิเล็กโทรสเปรย์เชิงลบc – e Metabolites ที่มีความอุดมสมบูรณ์แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในสองกลุ่ม (การทดสอบอันดับ Wilcoxon แบบลงนามสองด้าน, อัตราการค้นพบที่ผิดพลาดที่ปรับค่า p, FDR <0.05) จะแสดงเป็นสีแดง (การเปลี่ยนแปลงแบบพับ> 1.2) และสีน้ำเงิน (การเปลี่ยนแปลงแบบพับ <0.83) .) ปรากฏบนกราฟิกภูเขาไฟแผนที่ความร้อนการจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในจำนวนของสารเมตาบอไลต์ที่มีคำอธิบายประกอบระหว่าง LA และ BNข้อมูลต้นฉบับมีให้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลต้นฉบับ
เมแทบอโลมในซีรั่มทั้งหมดของ 174 HC, 170 BN และ 136 LA ในกลุ่มการค้นพบได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ UPLC-HRMSก่อนอื่นเราแสดงให้เห็นว่ากลุ่มตัวอย่างการควบคุมคุณภาพ (QC) รวมตัวกันอย่างแน่นหนาที่ศูนย์กลางของแบบจำลองการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ที่ไม่ได้รับการดูแล เพื่อยืนยันความเสถียรของประสิทธิภาพของการศึกษาในปัจจุบัน (รูปที่ 2 เพิ่มเติม)
ดังที่แสดงในการวิเคราะห์จำแนกกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน (PLS-DA) ในรูปที่ 1 b เราพบว่ามีความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่าง LA และ BN, LA และ HC ในโหมดอิเล็กโตรสเปรย์อิออนแบบบวก (+ESI) และลบ (−ESI) .โดดเดี่ยว.อย่างไรก็ตาม ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่าง BN และ HC ในเงื่อนไข +ESI และ -ESI
เราพบคุณลักษณะที่แตกต่างกัน 382 รายการระหว่าง LA และ HC, คุณลักษณะที่แตกต่างกัน 231 รายการระหว่าง LA และ BN และคุณลักษณะที่แตกต่างกัน 95 รายการระหว่าง BN และ HC (การทดสอบอันดับโดย Wilcoxon, FDR <0.05 และการเปลี่ยนแปลงหลายรายการ >1.2 หรือ <0.83) (รูปที่ .1c-e )..พีคได้รับการเพิ่มความคิดเห็นเพิ่มเติม (ข้อมูลเสริม 3) กับฐานข้อมูล (ไลบรารี mzCloud / HMDB / Chemspider) โดยค่า m / z เวลาการเก็บรักษาและการค้นหาสเปกตรัมมวลการกระจายตัว (รายละเอียดที่อธิบายไว้ในส่วนวิธีการ)ในที่สุดก็มีการระบุสารที่มีคำอธิบายประกอบ 33 และ 38 รายการที่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์สำหรับ LA เทียบกับ BN (รูปที่ 1f และตารางเสริม 2) และ LA เทียบกับ HC (รูปที่ 3 เสริมและตารางเสริม 2) ตามลำดับในทางตรงกันข้าม มีการระบุเพียง 3 เมตาบอไลต์ที่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ใน BN และ HC (ตารางเสริม 2) ซึ่งสอดคล้องกับการทับซ้อนกันระหว่าง BN และ HC ใน PLS-DAสารดิฟเฟอเรนเชียลเหล่านี้ครอบคลุมชีวเคมีหลากหลายชนิด (รูปที่ 4 เพิ่มเติม)เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในเมตาโบโลมในซีรั่มที่สะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงที่ร้ายแรงของมะเร็งปอดระยะเริ่มแรก เมื่อเปรียบเทียบกับก้อนเนื้อในปอดที่ไม่ร้ายแรงหรือผู้ที่มีสุขภาพดีในขณะเดียวกัน ความคล้ายคลึงกันของเมตาโบโลมในซีรั่มของ BN และ HC แสดงให้เห็นว่าก้อนเนื้อในปอดที่เป็นพิษเป็นภัยอาจมีลักษณะทางชีวภาพหลายอย่างร่วมกับบุคคลที่มีสุขภาพดีเนื่องจากการกลายพันธุ์ของยีนตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนัง (EGFR) นั้นพบได้บ่อยในมะเร็งของต่อมในปอดชนิดย่อย 23 เราจึงพยายามตรวจสอบผลกระทบของการกลายพันธุ์ของตัวขับต่อการเผาผลาญของซีรั่มจากนั้นเราวิเคราะห์โปรไฟล์การเผาผลาญโดยรวมของ 72 รายที่มีสถานะ EGFR ในกลุ่มมะเร็งของต่อมในปอดสิ่งที่น่าสนใจคือเราพบโปรไฟล์ที่เปรียบเทียบได้ระหว่างผู้ป่วยกลายพันธุ์ EGFR (n = 41) และผู้ป่วยประเภทป่า EGFR (n = 31) ในการวิเคราะห์ PCA (รูปที่ 5a เพิ่มเติม)อย่างไรก็ตาม เราระบุสาร 7 ชนิดที่มีการเปลี่ยนแปลงมากมายอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ EGFR เมื่อเปรียบเทียบกับผู้ป่วยที่มี EGFR แบบไวด์ (การทดสอบ t, p <0.05 และการเปลี่ยนแปลงการพับ> 1.2 หรือ <0.83) (รูปที่ 5b เพิ่มเติม)สารส่วนใหญ่เหล่านี้ (5 ใน 7) คืออะซิลคาร์นิทีน ซึ่งมีบทบาทสำคัญในกระบวนการออกซิเดชันของกรดไขมัน
ดังที่แสดงไว้ในขั้นตอนการทำงานที่แสดงในรูปที่ 2 a ตัวชี้วัดทางชีวภาพสำหรับการจำแนกประเภทปมได้รับโดยใช้ตัวดำเนินการการหดตัวสัมบูรณ์น้อยที่สุดและการเลือกโดยอิงจากสารอนุพันธ์ 33 ชนิดที่ระบุใน LA (n = 136) และ BN (n = 170)ชุดค่าผสมที่ดีที่สุดของตัวแปร (LASSO) – แบบจำลองการถดถอยลอจิสติกแบบไบนารีมีการใช้การตรวจสอบข้ามสิบเท่าเพื่อทดสอบความน่าเชื่อถือของแบบจำลองการเลือกตัวแปรและการปรับพารามิเตอร์ให้เป็นมาตรฐานจะถูกปรับโดยการปรับค่าความน่าจะเป็นสูงสุดด้วยพารามิเตอร์ แล24การวิเคราะห์เมแทบอลิซึมทั่วโลกดำเนินการเพิ่มเติมอย่างอิสระในกลุ่มการตรวจสอบภายใน (n = 104) และการตรวจสอบภายนอก (n = 111) เพื่อทดสอบประสิทธิภาพการจำแนกประเภทของแบบจำลองจำแนกเป็นผลให้สาร 27 รายการในชุดการค้นพบถูกระบุว่าเป็นแบบจำลองจำแนกที่ดีที่สุดโดยมีค่า AUC เฉลี่ยที่ใหญ่ที่สุด (รูปที่ 2b) โดยในจำนวนนี้ 9 รายการมีกิจกรรมเพิ่มขึ้นและกิจกรรมลดลง 18 รายการใน LA เมื่อเทียบกับ BN (รูปที่ 2c)
ขั้นตอนการทำงานสำหรับการสร้างตัวแยกประเภทปมปอด รวมถึงการเลือกแผงที่ดีที่สุดของสารเมตาบอไลต์ในซีรั่มในชุดการค้นพบโดยใช้แบบจำลองการถดถอยโลจิสติกแบบไบนารีผ่านการตรวจสอบความถูกต้องข้ามสิบเท่า และการประเมินประสิทธิภาพการทำนายในชุดการตรวจสอบความถูกต้องทั้งภายในและภายนอกb สถิติการตรวจสอบข้ามของแบบจำลองการถดถอย LASSO สำหรับการเลือกไบโอมาร์คเกอร์เมตาบอลิซึมตัวเลขที่ให้ไว้ข้างต้นแสดงถึงจำนวนเฉลี่ยของตัวชี้วัดทางชีวภาพที่เลือกไว้ที่ แล ที่กำหนดเส้นประสีแดงแสดงถึงค่า AUC เฉลี่ยที่แลมบ์ดาที่สอดคล้องกันแถบข้อผิดพลาดสีเทาแสดงถึงค่า AUC ต่ำสุดและสูงสุดเส้นประบ่งบอกถึงรุ่นที่ดีที่สุดด้วยไบโอมาร์คเกอร์ที่เลือก 27 รายการAUC พื้นที่ใต้เส้นโค้งลักษณะการทำงานของเครื่องรับ (ROC)c พับการเปลี่ยนแปลงของสารที่เลือก 27 รายการในกลุ่ม LA เปรียบเทียบกับกลุ่ม BN ในกลุ่มการค้นพบคอลัมน์สีแดง – การเปิดใช้งานคอลัมน์สีน้ำเงินเป็นการลดลงเส้นโค้งลักษณะการทำงานของตัวรับ (ROC) d–f แสดงพลังของแบบจำลองจำแนกตามการรวมกันของเมตาบอไลท์ 27 รายการในชุดการตรวจสอบการค้นพบ การตรวจสอบภายในและภายนอกข้อมูลต้นฉบับมีให้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลต้นฉบับ
แบบจำลองการทำนายถูกสร้างขึ้นตามค่าสัมประสิทธิ์การถดถอยแบบถ่วงน้ำหนักของสาร 27 ชนิดเหล่านี้ (ตารางเสริม 3)การวิเคราะห์ ROC ที่อิงจากเมตาบอไลต์ 27 ชนิดเหล่านี้ให้ค่าพื้นที่ใต้เส้นโค้ง (AUC) เท่ากับ 0.933 ความไวของกลุ่มการค้นพบคือ 0.868 และความจำเพาะคือ 0.859 (รูปที่ 2d)ในขณะเดียวกันในบรรดาสารอนุพันธ์ที่มีคำอธิบายประกอบ 38 รายการระหว่าง LA และ HC ชุดของสาร 16 ชนิดได้รับ AUC ที่ 0.902 โดยมีความไว 0.801 และความจำเพาะที่ 0.856 ในการเลือกปฏิบัติ LA จาก HC (รูปที่ 6a-c เพิ่มเติม)นอกจากนี้ยังเปรียบเทียบค่า AUC ตามเกณฑ์การเปลี่ยนแปลงการพับที่แตกต่างกันสำหรับสารอนุพันธ์ที่แตกต่างกันด้วยเราพบว่าแบบจำลองการจำแนกประเภททำงานได้ดีที่สุดในการแยกแยะระหว่าง LA และ BN (HC) เมื่อตั้งค่าระดับการเปลี่ยนแปลงการพับเป็น 1.2 เทียบกับ 1.5 หรือ 2.0 (รูปที่ 7a, b เพิ่มเติม)แบบจำลองการจำแนกประเภทตามกลุ่มเมตาบอไลท์ 27 กลุ่ม ได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมในกลุ่มประชากรตามรุ่นทั้งภายในและภายนอกAUC คือ 0.915 (ความไว 0.867, ความจำเพาะ 0.811) สำหรับการตรวจสอบภายในและ 0.945 (ความไว 0.810, ความจำเพาะ 0.979) สำหรับการตรวจสอบภายนอก (รูปที่ 2e, f)เพื่อประเมินประสิทธิภาพระหว่างห้องปฏิบัติการ มีการวิเคราะห์ตัวอย่าง 40 ตัวอย่างจากกลุ่มภายนอกในห้องปฏิบัติการภายนอกตามที่อธิบายไว้ในส่วนวิธีการความแม่นยำในการจำแนกประเภทบรรลุ AUC ที่ 0.925 (รูปที่ 8 เพิ่มเติม)เนื่องจากมะเร็งปอดชนิดสความัสเซลล์ (LUSC) เป็นชนิดย่อยที่พบบ่อยเป็นอันดับสองของมะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์ขนาดเล็ก (NSCLC) หลังจากมะเร็งของต่อมในปอด (LUAD) เราจึงได้ทดสอบประโยชน์ใช้สอยที่เป็นไปได้ของโปรไฟล์เมตาบอลิซึมที่ผ่านการตรวจสอบแล้วBN และ LUSC 16 รายAUC ของการเลือกปฏิบัติระหว่าง LUSC และ BN อยู่ที่ 0.776 (รูปที่ 9 เพิ่มเติม) ซึ่งบ่งชี้ถึงความสามารถที่แย่กว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการเลือกปฏิบัติระหว่าง LUAD และ BN
การศึกษาพบว่าขนาดของก้อนในภาพ CT มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับความน่าจะเป็นของมะเร็งและยังคงเป็นปัจจัยสำคัญในการรักษาก้อนเนื้องอก25,26,27การวิเคราะห์ข้อมูลจากการศึกษาแบบคัดกรองกลุ่มใหญ่ของ NELSON แสดงให้เห็นว่าความเสี่ยงของการเกิดมะเร็งในอาสาสมัครที่มีโหนด <5 มม. ยังใกล้เคียงกับความเสี่ยงในอาสาสมัครที่ไม่มีโหนด 28 ด้วยซ้ำดังนั้น ขนาดขั้นต่ำที่จำเป็นต้องมีการตรวจสอบ CT เป็นประจำคือ 5 มม. ตามที่ British Thoracic Society (BTS) แนะนำ และ 6 มม. ตามที่ Fleischner Society 29 แนะนำอย่างไรก็ตาม ก้อนที่มีขนาดใหญ่กว่า 6 มม. และไม่มีคุณสมบัติที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยที่ชัดเจน เรียกว่าก้อนเนื้อในปอดที่ไม่แน่นอน (IPN) ยังคงเป็นความท้าทายที่สำคัญในการประเมินและการจัดการในการปฏิบัติทางคลินิกต่อไปเราจะตรวจสอบว่าขนาดของปมมีอิทธิพลต่อลายเซ็นเมแทบอลิซึมหรือไม่โดยใช้ตัวอย่างที่รวบรวมจากกลุ่มการค้นพบและการตรวจสอบภายในโดยมุ่งเน้นไปที่ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว 27 รายการ อันดับแรกเราจะเปรียบเทียบโปรไฟล์ PCA ของเมตาโบโลมที่มีขนาดต่ำกว่า 6 มม. ของ HC และ BNเราพบว่าจุดข้อมูลส่วนใหญ่สำหรับ HC และ BN ทับซ้อนกัน ซึ่งแสดงให้เห็นว่าระดับเมตาบอไลต์ในซีรั่มมีความคล้ายคลึงกันในทั้งสองกลุ่ม (รูปที่ 3a)แผนผังคุณลักษณะในช่วงขนาดที่แตกต่างกันยังคงได้รับการอนุรักษ์ใน BN และ LA (รูปที่ 3b, c) ในขณะที่สังเกตการแยกระหว่างก้อนเนื้อร้ายและก้อนที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยในช่วง 6–20 มม. (รูปที่ 3 มิติ)กลุ่มนี้มี AUC เท่ากับ 0.927 ความจำเพาะ 0.868 และความไว 0.820 สำหรับการทำนายความร้ายกาจของก้อนขนาด 6 ถึง 20 มม. (รูปที่ 3e, f)ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าตัวแยกประเภทสามารถจับการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงของมะเร็งในระยะเริ่มแรก โดยไม่คำนึงถึงขนาดของปม
การเปรียบเทียบโปรไฟล์ PCA ระหว่างกลุ่มที่ระบุโดยอิงตามตัวแยกประเภทเมตาบอลิซึมของ 27 เมตาบอไลต์CC และ BN < 6 มม.b BN < 6 มม. เทียบกับ BN 6–20 มม.ใน LA 6–20 มม. เทียบกับ LA 20–30 มม.g BN 6–20 มม. และ LA 6–20 มม.GC, n = 174;บีเอ็น < 6 มม., n = 153;BN 6–20 มม. n = 91;แอลเอ 6–20 มม. n = 89;LA 20–30 มม., n = 77 e เส้นโค้งลักษณะการทำงานของตัวรับ (ROC) แสดงประสิทธิภาพของแบบจำลองจำแนกสำหรับก้อนขนาด 6–20 มม.f ค่าความน่าจะเป็นคำนวณตามแบบจำลองการถดถอยโลจิสติกสำหรับก้อนขนาด 6–20 มม.เส้นประสีเทาแสดงถึงค่าจุดตัดที่เหมาะสมที่สุด (0.455)ตัวเลขข้างต้นแสดงถึงเปอร์เซ็นต์ของคดีที่คาดการณ์ไว้สำหรับลอสแอนเจลิสใช้แบบทดสอบนักเรียนแบบสองด้านPCA การวิเคราะห์องค์ประกอบหลักพื้นที่ AUC ใต้โค้งข้อมูลต้นฉบับมีให้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลต้นฉบับ
ตัวอย่างสี่ตัวอย่าง (อายุ 44–61 ปี) ที่มีขนาดปมปอดใกล้เคียงกัน (7–9 มม.) ได้รับการคัดเลือกเพิ่มเติมเพื่อแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของแบบจำลองการทำนายมะเร็งที่เสนอ (รูปที่ 4a, b)ในการตรวจคัดกรองเบื้องต้น กรณีที่ 1 ปรากฏเป็นก้อนเนื้อแข็งและกลายเป็นปูน ซึ่งเป็นลักษณะที่เกี่ยวข้องกับความเป็นพิษเป็นภัย ในขณะที่กรณีที่ 2 ปรากฏเป็นก้อนเนื้อแข็งบางส่วนที่ไม่แน่นอน และไม่มีลักษณะที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยที่ชัดเจนการสแกน CT ติดตามผลสามรอบแสดงให้เห็นว่ากรณีเหล่านี้ยังคงมีเสถียรภาพในช่วงระยะเวลา 4 ปี ดังนั้นจึงถือว่าเป็นก้อนที่ไม่ร้ายแรง (รูปที่ 4a)เมื่อเปรียบเทียบกับการประเมินทางคลินิกของการสแกน CT แบบอนุกรม การวิเคราะห์เมตาบอไลต์ในซีรั่มนัดเดียวด้วยแบบจำลองลักษณนามปัจจุบันสามารถระบุก้อนที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยเหล่านี้ได้อย่างรวดเร็วและถูกต้องตามข้อจำกัดความน่าจะเป็น (ตารางที่ 1)รูปที่ 4b ในกรณีที่ 3 แสดงก้อนเนื้อที่มีสัญญาณของการหดตัวของเยื่อหุ้มปอด ซึ่งมักเกี่ยวข้องกับมะเร็ง32กรณีที่ 4 แสดงเป็นก้อนเนื้อแข็งบางส่วนไม่ทราบแน่ชัด โดยไม่มีหลักฐานว่ามีสาเหตุที่ไม่ร้ายแรงกรณีทั้งหมดเหล่านี้ถูกคาดการณ์ว่าเป็นมะเร็งตามแบบจำลองลักษณนาม (ตารางที่ 1)การประเมินมะเร็งของต่อมในปอดแสดงให้เห็นโดยการตรวจทางจุลพยาธิวิทยาหลังการผ่าตัดปอด (รูปที่ 4b)สำหรับชุดการตรวจสอบความถูกต้องภายนอก ตัวแยกประเภทเมตาบอลิซึมทำนายได้อย่างแม่นยำสองกรณีของก้อนเนื้อปอดที่ไม่แน่นอนที่มีขนาดใหญ่กว่า 6 มม. (รูปที่ 10 เพิ่มเติม)
ภาพ CT ของหน้าต่างแนวแกนของปอดของก้อนเนื้องอกที่ไม่ร้ายแรง 2 รายในกรณีที่ 1 การสแกน CT หลังจากผ่านไป 4 ปี พบว่าก้อนเนื้อแข็งที่มีขนาด 7 มม. มีแคลเซียมในกลีบล่างขวาในกรณีที่ 2 การสแกน CT หลังจากผ่านไป 5 ปี พบว่ามีก้อนเนื้อแข็งบางส่วนที่มั่นคง โดยมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 7 มม. ในกลีบบนด้านขวาb ภาพ CT ของหน้าต่างแกนของปอดและการศึกษาทางพยาธิวิทยาที่สอดคล้องกันของมะเร็งของต่อมในมะเร็งระยะที่ 1 สองกรณีก่อนการผ่าตัดปอดกรณีที่ 3 พบก้อนเนื้อที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 8 มม. ในกลีบบนขวาและมีเยื่อหุ้มปอดหดตัวกรณีที่ 4 พบก้อนแก้วพื้นแข็งบางส่วนซึ่งมีขนาด 9 มม. ในกลีบบนด้านซ้ายการย้อมสี Hematoxylin และ eosin (H&E) ของเนื้อเยื่อปอดที่ได้รับการแก้ไข (สเกลบาร์ = 50 μm) แสดงให้เห็นถึงรูปแบบการเจริญเติบโตของ acinar ของมะเร็งของต่อมในปอดลูกศรบ่งบอกถึงก้อนที่ตรวจพบในภาพ CTภาพ H&E เป็นภาพตัวแทนของช่องกล้องจุลทรรศน์หลายช่อง (>3) ที่ตรวจโดยนักพยาธิวิทยา
เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นถึงมูลค่าที่เป็นไปได้ของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของสารเมตาบอไลต์ในซีรั่มในการวินิจฉัยแยกโรคของก้อนเนื้อในปอด ซึ่งอาจก่อให้เกิดความท้าทายเมื่อประเมินการตรวจคัดกรอง CT
จากแผงเมตาบอไลท์ดิฟเฟอเรนเชียลที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว เราพยายามระบุความสัมพันธ์ทางชีวภาพของการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมที่สำคัญการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าวิถีทาง KEGG โดย MetaboAnalyst ระบุวิถีทางที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญทั่วไป 6 ประการระหว่างสองกลุ่มที่กำหนด (LA เทียบกับ HC และ LA เทียบกับ BN, ปรับ p ≤ 0.001, เอฟเฟกต์ > 0.01)การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้มีลักษณะเฉพาะโดยการรบกวนในการเผาผลาญไพรูเวต, เมแทบอลิซึมของทริปโตเฟน, เมแทบอลิซึมของไนอาซินและนิโคตินาไมด์, ไกลโคไลซิส, วงจร TCA และเมแทบอลิซึมของพิวรีน (รูปที่ 5a)จากนั้นเราดำเนินการเมแทบอลิซึมแบบกำหนดเป้าหมายเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญโดยใช้การหาปริมาณสัมบูรณ์การกำหนดสารทั่วไปในวิถีทางที่เปลี่ยนแปลงโดยทั่วไปโดยเครื่องสเปกโตรมิเตอร์มวลสี่เท่า (QQQ) โดยใช้มาตรฐานสารแท้จริงลักษณะทางประชากรศาสตร์ของตัวอย่างเป้าหมายการศึกษาเมตาโบโลมิกส์รวมอยู่ในตารางเสริม 4 สอดคล้องกับผลลัพธ์เมแทบอลิซึมทั่วโลกของเรา การวิเคราะห์เชิงปริมาณยืนยันว่าไฮโปแซนทีนและแซนทีน ไพรูเวต และแลคเตตเพิ่มขึ้นใน LA เมื่อเปรียบเทียบกับ BN และ HC (รูปที่ 5b, c, พิ <0.05)อย่างไรก็ตาม ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในสารเหล่านี้ระหว่าง BN และ HC
การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าวิถีของ KEGG ของสารที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม LA เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม BN และ HCใช้ Globaltest แบบสองด้าน และค่า p ถูกปรับโดยใช้วิธี Holm-Bonferroni (ปรับ p ≤ 0.001 และขนาดเอฟเฟกต์ > 0.01)แปลงไวโอลิน b – d แสดงระดับไฮโปแซนทีน แซนทีน แลคเตต ไพรูเวต และทริปโตเฟนในซีรั่ม HC, BN และ LA กำหนดโดย LC-MS/MS (n = 70 ต่อกลุ่ม)เส้นประสีขาวและสีดำแสดงถึงค่ามัธยฐานและควอไทล์ตามลำดับพล็อตไวโอลินแสดง Log2TPM ที่เป็นมาตรฐาน (การถอดเสียงต่อล้าน) การแสดงออก mRNA ของ SLC7A5 และ QPRT ในมะเร็งของต่อมในปอด (n = 513) เมื่อเปรียบเทียบกับเนื้อเยื่อปอดปกติ (n = 59) ในชุดข้อมูล LUAD-TCGAกล่องสีขาวแสดงถึงช่วงระหว่างควอไทล์ เส้นสีดำแนวนอนตรงกลางแสดงถึงค่ามัธยฐาน และเส้นสีดำแนวตั้งที่ยื่นออกมาจากกล่องแสดงถึงช่วงความเชื่อมั่น 95% (CI)พล็อตความสัมพันธ์ของเพียร์สันของการแสดงออกของ SLC7A5 และ GAPDH ในมะเร็งของต่อมในปอด (n = 513) และเนื้อเยื่อปอดปกติ (n = 59) ในชุดข้อมูล TCGAพื้นที่สีเทาแสดงถึง 95% CIr สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สันg ระดับทริปโตเฟนของเซลล์ที่ทำให้เป็นมาตรฐานในเซลล์ A549 ที่ถูกถ่ายด้วยการควบคุม shRNA ที่ไม่เฉพาะเจาะจง (NC) และ shSLC7A5 (Sh1, Sh2) กำหนดโดย LC-MS/MSนำเสนอการวิเคราะห์ทางสถิติของตัวอย่างทางชีวภาพห้าตัวอย่างในแต่ละกลุ่มh ระดับเซลล์ของ NADt (NAD ทั้งหมดรวมถึง NAD+ และ NADH) ในเซลล์ A549 (NC) และเซลล์ A549 ที่ล้มลง SLC7A5 (Sh1, Sh2)นำเสนอการวิเคราะห์ทางสถิติของตัวอย่างทางชีวภาพสามตัวอย่างในแต่ละกลุ่มกิจกรรมไกลโคไลติกของเซลล์ A549 ก่อนและหลังการล้มลงของ SLC7A5 ถูกวัดโดยอัตราการเป็นกรดนอกเซลล์ (ECAR) (n = 4 ตัวอย่างอิสระทางชีวภาพต่อกลุ่ม)2-DG,2-ดีออกซี-D-กลูโคสใช้แบบทดสอบของนักเรียนแบบสองด้านใน (b–h)ใน ( g – i ) แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± SD การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการอย่างอิสระสามครั้งและผลลัพธ์ก็คล้ายกันข้อมูลต้นฉบับมีให้ในรูปแบบของไฟล์ข้อมูลต้นฉบับ
เมื่อพิจารณาถึงผลกระทบที่สำคัญของการเปลี่ยนแปลงเมแทบอลิซึมของทริปโตเฟนในกลุ่ม LA เรายังประเมินระดับทริปโตเฟนในซีรั่มในกลุ่ม HC, BN และ LA โดยใช้ QQQเราพบว่าเซรั่มทริปโตเฟนลดลงใน LA เมื่อเทียบกับ HC หรือ BN (p <0.001, รูปที่ 5d) ซึ่งสอดคล้องกับการค้นพบก่อนหน้านี้ว่าระดับทริปโตเฟนที่ไหลเวียนนั้นต่ำกว่าในผู้ป่วยมะเร็งปอดมากกว่าในกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดีจากกลุ่มควบคุม 33,34 ,35.การศึกษาอื่นที่ใช้ตัวติดตาม PET/CT 11C-methyl-L-tryptophan พบว่าระยะเวลาในการคงสัญญาณทริปโตเฟนในเนื้อเยื่อมะเร็งปอดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับรอยโรคที่ไม่ร้ายแรงหรือเนื้อเยื่อปกติ36เราตั้งสมมติฐานว่าการลดลงของทริปโตเฟนในซีรั่ม LA อาจสะท้อนถึงการดูดซึมทริปโตเฟนโดยเซลล์มะเร็งปอด
เป็นที่ทราบกันดีว่าผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายของวิถีไคนูรีนีนของโพรไบโอลิซึมของทริปโตเฟนคือ NAD+37,38 ซึ่งเป็นสารตั้งต้นที่สำคัญสำหรับปฏิกิริยาของกลีเซอรัลดีไฮด์-3-ฟอสเฟตกับ 1,3-บิสฟอสโฟกลีเซอเรตในไกลโคไลซิสในขณะที่การศึกษาก่อนหน้านี้มุ่งเน้นไปที่บทบาทของโพรไบโอลิซึมในการควบคุมระบบภูมิคุ้มกัน เราพยายามที่จะอธิบายการทำงานร่วมกันระหว่างความผิดปกติของทริปโตเฟนและวิถีไกลโคไลติกที่พบในการศึกษาปัจจุบันตระกูลตัวขนส่งตัวถูกละลาย 7 สมาชิก 5 (SLC7A5) เป็นที่รู้กันว่าเป็นตัวขนส่งทริปโตเฟน43,44,45กรดควิโนลินิก ฟอสโฟริโบซิลทรานสเฟอเรส (QPRT) เป็นเอนไซม์ที่อยู่ท้ายน้ำของทางเดินไคนูรีนีนที่จะแปลงกรดควิโนลินิกเป็น NAMN46การตรวจสอบชุดข้อมูล LUAD TCGA พบว่าทั้ง SLC7A5 และ QPRT ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อเนื้องอกเมื่อเปรียบเทียบกับเนื้อเยื่อปกติ (รูปที่ 5e)การเพิ่มขึ้นนี้พบได้ในระยะที่ 1 และ 2 เช่นเดียวกับระยะที่ 3 และ 4 ของมะเร็งของต่อมในปอด (รูปที่ 11 เพิ่มเติม) ซึ่งบ่งชี้ถึงการรบกวนในช่วงต้นของการเผาผลาญทริปโตเฟนที่เกี่ยวข้องกับการเกิดเนื้องอก
นอกจากนี้ ชุดข้อมูล LUAD-TCGA แสดงความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างการแสดงออกของ SLC7A5 และ GAPDH mRNA ในตัวอย่างผู้ป่วยมะเร็ง (r = 0.45, p = 1.55E-26, รูปที่ 5f)ในทางตรงกันข้าม ไม่พบความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญระหว่างลายเซ็นของยีนดังกล่าวในเนื้อเยื่อปอดปกติ (r = 0.25, p = 0.06, รูปที่ 5f)การล้มลงของ SLC7A5 (รูปที่ 12 เพิ่มเติม) ในเซลล์ A549 ลดระดับโพรไบโอเฟนของเซลล์และ NAD (H) อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5g, h) ส่งผลให้กิจกรรมไกลโคไลติกลดทอนลงโดยวัดโดยอัตราการทำให้เป็นกรดนอกเซลล์ (ECAR) (รูปที่ 1)5i)ดังนั้น จากการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมในซีรั่มและการตรวจหา ในหลอดทดลอง เราตั้งสมมติฐานว่าเมแทบอลิซึมของทริปโตเฟนอาจสร้าง NAD + ผ่านวิถีไคนูรีนีน และมีบทบาทสำคัญในการส่งเสริมไกลโคไลซิสในมะเร็งปอด
การศึกษาพบว่าก้อนเนื้อในปอดที่ไม่แน่นอนจำนวนมากที่ตรวจพบโดย LDCT อาจนำไปสู่ความจำเป็นในการทดสอบเพิ่มเติม เช่น PET-CT การตัดชิ้นเนื้อปอด และการรักษามากเกินไป เนื่องจากการวินิจฉัยมะเร็งที่เป็นบวกลวง31 ดังแสดงในรูปที่ 6 การศึกษาของเราระบุแผงของสารเมตาบอไลต์ในซีรั่มที่มีค่าการวินิจฉัยที่เป็นไปได้ซึ่งอาจปรับปรุงการแบ่งชั้นความเสี่ยงและการจัดการก้อนเนื้อในปอดที่ตรวจพบโดย CT ในภายหลัง
ก้อนเนื้อในปอดได้รับการประเมินโดยใช้เครื่องเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ขนาดต่ำ (LDCT) พร้อมคุณสมบัติการถ่ายภาพที่ชี้นำถึงสาเหตุที่ไม่ร้ายแรงหรือร้ายแรงผลลัพธ์ที่ไม่แน่นอนของก้อนเนื้อสามารถนำไปสู่การนัดตรวจติดตามผลบ่อยครั้ง การแทรกแซงที่ไม่จำเป็น และการรักษามากเกินไปการรวมตัวแยกประเภทการเผาผลาญในซีรั่มที่มีค่าการวินิจฉัยอาจปรับปรุงการประเมินความเสี่ยงและการจัดการก้อนในปอดในภายหลังเอกซเรย์ปล่อยโพซิตรอน PET
ข้อมูลจากการศึกษา NLST ของสหรัฐอเมริกาและการศึกษาของ NELSON ของยุโรป ชี้ให้เห็นว่าการคัดกรองกลุ่มที่มีความเสี่ยงสูงด้วยการตรวจเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ขนาดต่ำ (LDCT) อาจลดการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งปอด1,3อย่างไรก็ตาม การประเมินความเสี่ยงและการจัดการทางคลินิกในภายหลังของก้อนเนื้อในปอดจำนวนมากที่ตรวจพบโดย LDCT ยังคงเป็นสิ่งที่ท้าทายที่สุดเป้าหมายหลักคือการเพิ่มประสิทธิภาพการจำแนกประเภทที่ถูกต้องของโปรโตคอลที่ใช้ LDCT ที่มีอยู่โดยการรวมตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่เชื่อถือได้
ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพระดับโมเลกุลบางตัว เช่น สารเมตาบอไลต์ในเลือด ได้รับการระบุโดยการเปรียบเทียบมะเร็งปอดกับกลุ่มควบคุมที่ดีต่อสุขภาพ15,17ในการศึกษาปัจจุบัน เรามุ่งเน้นไปที่การประยุกต์ใช้การวิเคราะห์เมแทบอลิซึมของซีรั่มเพื่อแยกแยะระหว่างก้อนเนื้อในปอดที่เป็นพิษเป็นภัยและที่ตรวจพบโดยบังเอิญโดย LDCTเราเปรียบเทียบเมตาโบโลมในซีรั่มทั่วโลกของการควบคุมสุขภาพที่ดี (HC), ก้อนเนื้อในปอดที่ไม่เป็นอันตราย (BN) และตัวอย่างมะเร็งของต่อมในปอดระยะที่ 1 (LA) โดยใช้การวิเคราะห์ UPLC-HRMSเราพบว่า HC และ BN มีโปรไฟล์การเผาผลาญที่คล้ายกัน ในขณะที่ LA แสดงการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ HC และ BNเราระบุสารเมตาบอไลต์ในซีรั่มสองชุดที่ทำให้ LA แตกต่างจาก HC และ BN
รูปแบบการระบุโดยอิง LDCT ในปัจจุบันสำหรับก้อนเนื้องอกที่เป็นพิษเป็นภัยและเนื้องอกที่เป็นพิษเป็นภัยนั้นส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับขนาด ความหนาแน่น สัณฐานวิทยา และอัตราการเติบโตของก้อนเนื้องอกเมื่อเวลาผ่านไปการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าขนาดของก้อนมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับโอกาสที่จะเป็นมะเร็งปอดแม้ในผู้ป่วยที่มีความเสี่ยงสูง ความเสี่ยงของมะเร็งในต่อมน้ำ <6 มม. คือ <1%ความเสี่ยงของการเกิดมะเร็งสำหรับก้อนขนาด 6 ถึง 20 มม. มีตั้งแต่ 8% ถึง 64% 30ดังนั้น Fleischner Society แนะนำให้ใช้เส้นผ่านศูนย์กลางจุดตัด 6 มม. สำหรับการติดตามผล CT ตามปกติ29 อย่างไรก็ตาม การประเมินความเสี่ยงและการจัดการก้อนเนื้อในปอดที่ไม่แน่นอน (IPN) ที่มีขนาดใหญ่กว่า 6 มม. ยังไม่ได้รับการดำเนินการอย่างเพียงพอ 31การจัดการโรคหัวใจพิการแต่กำเนิดในปัจจุบันมักอาศัยการรอคอยและการตรวจ CT เป็นประจำ
จากเมตาโบโลมที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว เราแสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกถึงความซ้ำซ้อนของลายเซ็นเมตาบอลิซึมระหว่างบุคคลที่มีสุขภาพดีและก้อนเนื้อที่ไม่ร้ายแรง <6 มม.ความคล้ายคลึงกันทางชีวภาพนั้นสอดคล้องกับการค้นพบ CT ก่อนหน้านี้ว่าความเสี่ยงของการเกิดมะเร็งสำหรับก้อน <6 มม. นั้นต่ำเท่ากับอาสาสมัครที่ไม่มีโหนด30 ควรสังเกตว่าผลลัพธ์ของเรายังแสดงให้เห็นว่าก้อนที่ไม่เป็นอันตราย <6 มม. และ ≥6 มม. มีสูง ความคล้ายคลึงกันในโปรไฟล์เมแทบอลิซึม ซึ่งบ่งชี้ว่าคำจำกัดความการทำงานของสาเหตุที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยนั้นสอดคล้องกันโดยไม่คำนึงถึงขนาดของปมดังนั้นแผงเมตาบอไลต์ในซีรั่มเพื่อการวินิจฉัยสมัยใหม่อาจจัดให้มีการทดสอบเพียงครั้งเดียวเป็นการทดสอบแบบออกกฎเมื่อตรวจพบก้อนใน CT ในตอนแรกและอาจลดการตรวจสอบแบบอนุกรมในเวลาเดียวกัน แผงตัวบ่งชี้ทางชีวภาพทางเมตาบอลิซึมชุดเดียวกันสามารถแยกแยะก้อนเนื้อร้ายที่มีขนาด ≥6 มม. จากก้อนที่ไม่เป็นพิษเป็นภัย และให้การคาดการณ์ที่แม่นยำสำหรับ IPN ที่มีขนาดใกล้เคียงกันและลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่ไม่ชัดเจนในภาพ CTตัวแยกประเภทเมแทบอลิซึมในซีรั่มนี้ทำงานได้ดีในการทำนายความร้ายกาจของก้อนเนื้อที่มีขนาด ≥6 มม. โดยมี AUC อยู่ที่ 0.927เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ของเราระบุว่าลายเซ็นเมแทบอลิซึมในซีรั่มที่เป็นเอกลักษณ์อาจสะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมที่เกิดจากเนื้องอกในระยะเริ่มแรกโดยเฉพาะ และมีคุณค่าที่เป็นไปได้ในฐานะตัวทำนายความเสี่ยง โดยไม่ขึ้นกับขนาดของปม
โดยเฉพาะอย่างยิ่งมะเร็งปอดของต่อม (LUAD) และมะเร็งเซลล์สความัส (LUSC) เป็นมะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์ขนาดเล็ก (NSCLC) ประเภทหลักเนื่องจาก LUSC มีความสัมพันธ์อย่างมากกับการใช้ยาสูบ และ LUAD เป็นเนื้อเยื่อวิทยาที่พบบ่อยที่สุดของก้อนเนื้อในปอดโดยบังเอิญที่ตรวจพบในการคัดกรอง CT แบบจำลองลักษณนามของเราถูกสร้างขึ้นโดยเฉพาะสำหรับตัวอย่างมะเร็งต่อมน้ำเหลืองระยะที่ 1Wang และเพื่อนร่วมงานยังมุ่งเน้นไปที่ LUAD และระบุลายเซ็นของไขมัน 9 แบบโดยใช้ lipidomics เพื่อแยกแยะมะเร็งปอดระยะเริ่มแรกจากบุคคลที่มีสุขภาพดีเราทดสอบโมเดลลักษณนามปัจจุบันใน 16 กรณีของระยะ I LUSC และ 74 ก้อนที่ไม่เป็นพิษเป็นภัย และสังเกตความแม่นยำในการทำนาย LUSC ต่ำ (AUC 0.776) ซึ่งบ่งชี้ว่า LUAD และ LUSC อาจมีลายเซ็นเมแทบอลิซึมของตัวเองแท้จริงแล้ว LUAD และ LUSC แสดงให้เห็นว่ามีความแตกต่างกันในด้านสาเหตุ ต้นกำเนิดทางชีวภาพ และความผิดปกติทางพันธุกรรมดังนั้น จึงควรรวมมิญชวิทยาประเภทอื่นไว้ในแบบจำลองการฝึกอบรมสำหรับการตรวจหามะเร็งปอดตามจำนวนประชากรในโครงการคัดกรอง
ที่นี่ เราได้ระบุวิถีทางที่เปลี่ยนแปลงบ่อยที่สุดหกวิถีในมะเร็งของต่อมในปอด เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมที่ดีต่อสุขภาพและก้อนเนื้อที่อ่อนโยนแซนทีนและไฮโปแซนทีนเป็นสารที่พบได้ทั่วไปในวิถีเมแทบอลิซึมของพิวรีนสอดคล้องกับผลลัพธ์ของเรา สารตัวกลางที่เกี่ยวข้องกับเมแทบอลิซึมของพิวรีนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในซีรั่มหรือเนื้อเยื่อของผู้ป่วยที่เป็นมะเร็งของต่อมในปอด เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดีหรือผู้ป่วยในระยะก่อนแพร่กระจายระดับแซนทีนและไฮโปแซนทีนในซีรั่มที่เพิ่มขึ้นอาจสะท้อนถึงแอแนบอลิซึมที่จำเป็นต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งอย่างรวดเร็วความผิดปกติของการเผาผลาญกลูโคสเป็นจุดเด่นที่รู้จักกันดีของการเผาผลาญของมะเร็งที่นี่เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของไพรูเวตและแลคเตตในกลุ่ม LA เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม HC และ BN ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้าของความผิดปกติของวิถีไกลโคไลติกในโปรไฟล์เมตาโบโลมในซีรั่มของผู้ป่วยมะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์ขนาดเล็ก (NSCLC) และ การควบคุมสุขภาพผลลัพธ์มีความสม่ำเสมอ52,53
ที่สำคัญเราสังเกตความสัมพันธ์แบบผกผันระหว่างเมแทบอลิซึมของไพรูเวตและทริปโตเฟนในซีรัมของมะเร็งของต่อมในปอดระดับทริปโตเฟนในเลือดลดลงในกลุ่ม LA เมื่อเทียบกับกลุ่ม HC หรือ BNสิ่งที่น่าสนใจคือการศึกษาขนาดใหญ่ก่อนหน้านี้โดยใช้กลุ่มประชากรตามรุ่นในอนาคตพบว่าทริปโตเฟนหมุนเวียนในระดับต่ำมีความสัมพันธ์กับความเสี่ยงที่เพิ่มขึ้นของโรคมะเร็งปอด 54ทริปโตเฟนเป็นกรดอะมิโนจำเป็นที่เราได้รับจากอาหารทั้งหมดเราสรุปได้ว่าการสูญเสียทริปโตเฟนในซีรัมในมะเร็งของต่อมในปอดอาจสะท้อนถึงการสูญเสียสารนี้อย่างรวดเร็วเป็นที่ทราบกันดีว่าผลลัพธ์สุดท้ายของแคแทบอลิซึมของทริปโตเฟนผ่านวิถีไคนูเรนีนเป็นแหล่งที่มาของการสังเคราะห์ NAD+ ใหม่เนื่องจาก NAD+ ผลิตขึ้นผ่านเส้นทางการกอบกู้เป็นหลัก ความสำคัญของ NAD+ ในการเผาผลาญทริปโตเฟนต่อสุขภาพและโรคจึงยังคงได้รับการพิจารณา46การวิเคราะห์ฐานข้อมูล TCGA ของเราแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของตัวขนส่งตัวละลายทริปโตเฟน 7A5 (SLC7A5) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในมะเร็งของต่อมในปอดเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมปกติ และมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการแสดงออกของเอนไซม์ไกลโคไลติก GAPDHการศึกษาก่อนหน้านี้มุ่งเน้นไปที่บทบาทของโพรไบโอลิซึมเป็นหลักในการยับยั้งการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต้านมะเร็งที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งการดูดซึมทริปโตเฟนโดยการล้มลงของ SLC7A5 ในเซลล์มะเร็งปอดส่งผลให้ระดับ NAD ของเซลล์ลดลงตามมาและการลดทอนของกิจกรรมไกลโคไลติกร่วมกันโดยสรุป การศึกษาของเราให้พื้นฐานทางชีววิทยาสำหรับการเปลี่ยนแปลงในเมตาบอลิซึมของซีรั่มที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงมะเร็งของมะเร็งของต่อมในปอด
การกลายพันธุ์ของ EGFR เป็นการกลายพันธุ์ของตัวขับที่พบบ่อยที่สุดในคนไข้ NSCLCในการศึกษาของเรา เราพบว่าผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ EGFR (n = 41) มีโปรไฟล์การเผาผลาญโดยรวมคล้ายกับผู้ป่วยที่มี EGFR ชนิดไวด์ (n = 31) แม้ว่าเราจะพบว่าระดับซีรั่มลดลงของผู้ป่วยกลายพันธุ์ EGFR บางรายในผู้ป่วยอะซิลคาร์นิทีนหน้าที่ที่กำหนดไว้ของอะซิลคาร์นิทีนคือการขนส่งหมู่อะซิลจากไซโตพลาสซึมไปยังเมทริกซ์ไมโตคอนเดรีย ซึ่งนำไปสู่การออกซิเดชันของกรดไขมันเพื่อผลิตพลังงาน 55สอดคล้องกับการค้นพบของเรา การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้ยังระบุโปรไฟล์การเผาผลาญที่คล้ายกันระหว่าง EGFR กลายพันธุ์และเนื้องอกชนิดป่า EGFR โดยการวิเคราะห์การเผาผลาญทั่วโลกของตัวอย่างเนื้อเยื่อมะเร็งของต่อมในปอด 102 ตัวอย่างสิ่งที่น่าสนใจคือยังพบเนื้อหาอะซิลคาร์นิทีนในกลุ่มกลายพันธุ์ EGFRดังนั้นไม่ว่าการเปลี่ยนแปลงของระดับอะซิลคาร์นิทีนจะสะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมที่เกิดจาก EGFR และวิถีทางของโมเลกุลที่ซ่อนอยู่อาจสมควรได้รับการศึกษาเพิ่มเติมหรือไม่
โดยสรุป การศึกษาของเราได้สร้างเครื่องแยกประเภทการเผาผลาญในซีรัมสำหรับการวินิจฉัยแยกโรคของก้อนเนื้อในปอด และเสนอขั้นตอนการทำงานที่สามารถปรับการประเมินความเสี่ยงให้เหมาะสม และอำนวยความสะดวกในการจัดการทางคลินิกโดยอาศัยการตรวจคัดกรอง CT scan
การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลมะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็น โรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็น และคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลมะเร็งมหาวิทยาลัยเจิ้งโจวในกลุ่มการค้นพบและการตรวจสอบภายในนั้น ซีรั่ม 174 ซีรั่มจากบุคคลที่มีสุขภาพดี และ 244 ซีรั่มจากก้อนเนื้องอกที่ไม่ร้ายแรงถูกรวบรวมจากบุคคลที่เข้ารับการตรวจสุขภาพประจำปีที่แผนกควบคุมและป้องกันมะเร็ง ศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็น และก้อนเนื้องอกที่ไม่เป็นอันตราย 166 กลุ่มเซรั่มมะเร็งของต่อมปอดระยะที่ 1 ถูกรวบรวมจากศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็นในกลุ่มตรวจสอบความถูกต้องภายนอก มีผู้ป่วยมะเร็งเนื้องอกชนิดไม่ร้ายแรง 48 ราย มะเร็งปอดของต่อมในปอดระยะที่ 39 รายจากโรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็น และมะเร็งของต่อมในปอดระยะที่ 1 จากโรงพยาบาลมะเร็งเจิ้งโจว 24 รายศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็นยังรวบรวมผู้ป่วยมะเร็งปอดเซลล์สความัสระยะที่ 1 จำนวน 16 รายเพื่อทดสอบความสามารถในการวินิจฉัยของตัวจำแนกประเภทเมตาบอลิซึมที่จัดตั้งขึ้น (ลักษณะผู้ป่วยแสดงในตารางที่ 5 เพิ่มเติม)ตัวอย่างจากกลุ่มการค้นพบและกลุ่มการตรวจสอบความถูกต้องภายในถูกรวบรวมระหว่างเดือนมกราคม 2018 ถึงเดือนพฤษภาคม 2020 ตัวอย่างสำหรับกลุ่มการตรวจสอบความถูกต้องภายนอกถูกรวบรวมระหว่างเดือนสิงหาคม 2021 ถึงตุลาคม 2022 เพื่อลดอคติทางเพศ จึงได้มอบหมายกรณีชายและหญิงจำนวนเท่ากันโดยประมาณให้กับแต่ละกรณี กลุ่มรุ่นทีมค้นพบและทีมตรวจสอบภายในเพศของผู้เข้าร่วมถูกกำหนดตามการรายงานด้วยตนเองได้รับความยินยอมจากผู้เข้าร่วมทุกคนและไม่มีการจ่ายค่าชดเชยผู้รับการทดลองที่มีก้อนที่ไม่ร้ายแรงคือผู้ที่มีคะแนนการสแกน CT คงที่ที่ 2 ถึง 5 ปี ณ เวลาที่ทำการวิเคราะห์ ยกเว้น 1 กรณีจากตัวอย่างการตรวจสอบความถูกต้องภายนอก ซึ่งได้รับการรวบรวมก่อนการผ่าตัดและได้รับการวินิจฉัยโดยจุลพยาธิวิทยายกเว้นโรคหลอดลมอักเสบเรื้อรังเก็บตัวอย่างมะเร็งของต่อมในปอดก่อนการผ่าตัดปอดและยืนยันโดยการวินิจฉัยทางพยาธิวิทยาเก็บตัวอย่างเลือดขณะอดอาหารในหลอดแยกซีรั่มโดยไม่มีสารต้านการแข็งตัวของเลือดตัวอย่างเลือดถูกจับเป็นลิ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่ 2851 × g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°C เพื่อรวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอนในซีรัมส่วนย่อยในซีรั่มถูกแช่แข็งที่ -80°C จนกระทั่งถูกสกัดด้วยเมตาบอไลต์กรมป้องกันมะเร็งและการตรวจสุขภาพของศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็นได้รวบรวมเซรั่มจำนวนหนึ่งจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีจำนวน 100 ราย ซึ่งรวมถึงชายและหญิงในจำนวนเท่ากันที่มีอายุระหว่าง 40 ถึง 55 ปีปริมาตรที่เท่ากันของตัวอย่างผู้ให้แต่ละรายถูกผสม, แหล่งรวมที่เป็นผลลัพธ์ถูกแบ่งส่วนและเก็บไว้ที่ -80°Cส่วนผสมของซีรั่มถูกใช้เป็นวัสดุอ้างอิงสำหรับการควบคุมคุณภาพและการสร้างมาตรฐานข้อมูล
ตัวอย่างซีรั่มอ้างอิงและตัวอย่างทดสอบถูกละลาย และสกัดสารเมตาโบไลต์โดยใช้วิธีการสกัดแบบรวม (MTBE/เมทานอล/น้ำ) 56โดยสรุป เซรั่ม 50 ไมโครลิตรผสมกับเมทานอลเย็นน้ำแข็ง 225 ไมโครลิตร และเมทิลเติร์ต-บิวทิลอีเทอร์ (MTBE) เย็นน้ำแข็ง 750 ไมโครลิตรคนส่วนผสมและบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 1 ชั่วโมงจากนั้นนำตัวอย่างมาผสมและกระแสน้ำวนผสมกับน้ำเกรด MS 188 ไมโครลิตรที่มีมาตรฐานภายใน (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine และ 13C6-isoleucine ซื้อจาก Cambridge Isotope Laboratories)จากนั้นของผสมถูกปั่นแยกที่ 15,000 × กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 °C และเฟสล่างถูกถ่ายโอนไปเป็นสองหลอด (หลอดละ 125 ไมโครลิตร) สำหรับการวิเคราะห์ LC-MS ในโหมดบวกและลบในที่สุด ตัวอย่างก็ถูกระเหยจนแห้งในหัวสุญญากาศความเร็วสูง
เมตาบอไลต์แห้งถูกสร้างใหม่ใน 120 ไมโครลิตรของอะซิโตไนไตรล์ 80% ปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาที และปั่นแยกที่ 15,000 × g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°Cส่วนลอยเหนือตะกอนถูกถ่ายโอนไปยังขวดแก้วสีเหลืองอำพันที่มีส่วนแทรกขนาดเล็กสำหรับการศึกษาเมแทบอลิกการวิเคราะห์เมตาโบโลมิกส์ที่ไม่ตรงเป้าหมายบนแพลตฟอร์มโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ-แมสสเปกโตรเมทรีความละเอียดสูง (UPLC-HRMS)เมตาโบไลต์ถูกแยกออกโดยใช้ระบบ Dionex Ultimate 3000 UPLC และคอลัมน์ ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 มม., 1.7 ไมโครเมตร, น้ำ)ในโหมดไอออนบวก เฟสเคลื่อนที่คือ 95% (A) และ 50% อะซีโตไนไตรล์ (B) แต่ละเฟสประกอบด้วยแอมโมเนียมอะซิเตต 10 มิลลิโมล/ลิตรและกรดฟอร์มิก 0.1%ในโหมดเชิงลบ เฟสเคลื่อนที่ A และ B มีอะซิโตไนไตรล์ 95% และ 50% ตามลำดับ ทั้งสองเฟสมีแอมโมเนียมอะซิเตต 10 มิลลิโมล / ลิตร pH = 9 โปรแกรมการไล่ระดับสีมีดังนี้: 0–0.5 นาที, 2% B;0.5–12 นาที 2–50% บี;12–14 นาที 50–98% บี;14–16 นาที 98% บี;16–16.1.นาที 98 –2% บี;16.1–20 นาที 2% B คอลัมน์ถูกคงไว้ที่ 40°C และตัวอย่างที่ 10°C ในเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติอัตราการไหลคือ 0.3 มล./นาที ปริมาตรการฉีดคือ 3 ไมโครลิตรแมสสเปกโตรมิเตอร์ Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) ที่มีแหล่งกำเนิดอิเล็กโทรสเปรย์ไอออไนเซชัน (ESI) ทำงานในโหมดสแกนเต็มรูปแบบและใช้ร่วมกับโหมดการตรวจสอบ ddMS2 เพื่อรวบรวมข้อมูลปริมาณมากพารามิเตอร์ MS ได้รับการตั้งค่าดังนี้: แรงดันสเปรย์ +3.8 kV/- 3.2 kV, อุณหภูมิของเส้นเลือดฝอย 320°C, ก๊าซป้องกัน 40 arb, ก๊าซเสริม 10 arb, อุณหภูมิเครื่องทำความร้อนของโพรบ 350°C, ช่วงการสแกน 70–1050 ม./ ชม. ปณิธาน.70,000 ข้อมูลได้มาโดยใช้ Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific)
เพื่อประเมินคุณภาพของข้อมูล ตัวอย่างการควบคุมคุณภาพแบบรวมกลุ่ม (QC) ถูกสร้างขึ้นโดยการเอาส่วนลอยเหนือตะกอน 10 ไมโครลิตรออกจากแต่ละตัวอย่างการฉีดตัวอย่างควบคุมคุณภาพหกรายการได้รับการวิเคราะห์ที่จุดเริ่มต้นของลำดับการวิเคราะห์เพื่อประเมินความเสถียรของระบบ UPLC-MSจากนั้นตัวอย่างการควบคุมคุณภาพจะถูกแนะนำเข้าสู่ชุดงานเป็นระยะๆตัวอย่างซีรัมทั้ง 11 แบทช์ในการศึกษานี้ได้รับการวิเคราะห์โดย LC-MSปริมาณส่วนของของผสมรวมในซีรัมจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 100 รายถูกใช้เป็นวัสดุอ้างอิงในแบทช์ตามลำดับเพื่อติดตามกระบวนการสกัดและปรับสำหรับผลแบบแบทช์ต่อแบทช์การวิเคราะห์เมแทบอลิซึมที่ไม่ตรงเป้าหมายของกลุ่มการค้นพบ กลุ่มการตรวจสอบภายใน และกลุ่มการตรวจสอบภายนอก ได้ดำเนินการที่ศูนย์เมตาโบโลมิกส์ของมหาวิทยาลัยซุนยัตเซ็นห้องปฏิบัติการภายนอกของศูนย์วิเคราะห์และทดสอบเทคโนโลยีมหาวิทยาลัยกวางตุ้งยังได้วิเคราะห์ตัวอย่าง 40 ตัวอย่างจากกลุ่มภายนอกเพื่อทดสอบประสิทธิภาพของแบบจำลองลักษณนาม
หลังจากการสกัดและการสร้างใหม่ ปริมาณสัมบูรณ์ของสารเมตาบอไลต์ในซีรัมถูกวัดโดยใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ-แมสสเปกโตรเมทรีแบบควบคู่กัน (Agilent 6495 ทริปเปิลสี่รูโพล) พร้อมด้วยแหล่งกำเนิดอิเล็กโทรสเปรย์ไอออไนเซชัน (ESI) ในโหมดการตรวจสอบปฏิกิริยาหลายปฏิกิริยา (MRM)คอลัมน์ ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 มม., 1.7 μm, น้ำ) ถูกนำมาใช้เพื่อแยกสารเฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยอะซิโตไนไตรล์ (B) 90% (A) และ 5% พร้อมด้วยแอมโมเนียมอะซิเตต 10 มิลลิโมล/ลิตร และสารละลายแอมโมเนีย 0.1%โปรแกรมการไล่ระดับสีมีดังนี้: 0–1.5 นาที, 0% B;1.5–6.5 นาที, 0–15% บี;6.5–8 นาที 15% บี;8–8.5 นาที, 15%–0% บี;8.5–11.5 นาที, 0%Bคอลัมน์ถูกคงไว้ที่ 40 °C และตัวอย่างที่ 10 °C ในเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติอัตราการไหลคือ 0.3 มล./นาทีและปริมาตรการฉีดคือ 1 ไมโครลิตรพารามิเตอร์ MS ได้รับการตั้งค่าดังนี้: แรงดันไฟฟ้าของเส้นเลือดฝอย ±3.5 kV, ความดันเครื่องพ่นยา 35 psi, การไหลของก๊าซจากฝัก 12 ลิตร/นาที, อุณหภูมิของก๊าซจากฝัก 350°C, อุณหภูมิของก๊าซในการทำให้แห้ง 250°C และการไหลของก๊าซของก๊าซในการทำให้แห้ง 14 ลิตร/นาทีการแปลง MRM ของทริปโตเฟน, ไพรูเวต, แลคเตต, ไฮโปแซนทีนและแซนทีนคือ 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 และ 151.0–1079 ตามลำดับ.รวบรวมข้อมูลโดยใช้ Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies)สำหรับตัวอย่างซีรัม ทริปโตเฟน, ไพรูเวต, แลคเตต, ไฮโปแซนทีนและแซนทีนถูกหาปริมาณโดยใช้กราฟการปรับเทียบของสารละลายของผสมมาตรฐานสำหรับตัวอย่างเซลล์ ปริมาณทริปโตเฟนถูกทำให้เป็นมาตรฐานภายในมาตรฐานภายในและมวลโปรตีนของเซลล์
การสกัดพีค (m/z และเวลาคงอยู่ (RT)) ถูกดำเนินการโดยใช้ Compound Discovery 3.1 และ TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific)เพื่อกำจัดความแตกต่างที่อาจเกิดขึ้นระหว่างแบทช์ แต่ละพีคที่เป็นลักษณะเฉพาะของตัวอย่างทดสอบจะถูกหารด้วยพีคที่เป็นลักษณะเฉพาะของวัสดุอ้างอิงจากแบทช์เดียวกันเพื่อให้ได้ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ของมาตรฐานภายในก่อนและหลังการกำหนดมาตรฐานแสดงในตารางเสริม 6 ความแตกต่างระหว่างทั้งสองกลุ่มมีลักษณะเฉพาะด้วยอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR <0.05, การทดสอบอันดับของ Wilcoxon) และการเปลี่ยนแปลงแบบพับ (>1.2 หรือ <0.83)ข้อมูล MS ดิบของคุณสมบัติที่แยกออกมาและข้อมูล MS ที่แก้ไขในซีรั่มอ้างอิงจะแสดงในข้อมูลเสริม 1 และข้อมูลเสริม 2 ตามลำดับคำอธิบายประกอบพีคถูกดำเนินการตามระดับที่กำหนดสี่ระดับของการจำแนก รวมถึงเมตาบอไลต์ที่ระบุ สารประกอบที่มีคำอธิบายประกอบเชิงสมมุติ คลาสของสารประกอบที่มีลักษณะเชิงสมมุติ และสารประกอบที่ไม่รู้จัก 22จากการค้นหาฐานข้อมูลใน Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) สารประกอบทางชีววิทยาที่มีมาตรฐานที่ตรวจสอบความถูกต้องตรงกันของ MS/MS หรือคำอธิบายประกอบที่ตรงกันทุกประการใน mzCloud (คะแนน > 85) หรือ Chemspider ได้ถูกเลือกให้เป็นตัวกลางระหว่างเมตาโบโลมเชิงอนุพันธ์ในที่สุดคำอธิบายประกอบสูงสุดสำหรับแต่ละฟีเจอร์จะรวมอยู่ในข้อมูลเสริม 3 MetaboAnalyst 5.0 ใช้สำหรับการวิเคราะห์แบบไม่แปรผันของความอุดมสมบูรณ์ของสารเมตาโบไลต์ที่ทำให้เป็นมาตรฐานMetaboAnalyst 5.0 ยังประเมินการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าวิถี KEGG โดยอิงจากสารเมตาบอไลต์ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) และการวิเคราะห์จำแนกกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน (PLS-DA) ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ ropls (v.1.26.4) พร้อมการปรับมาตรฐานสแต็กและการปรับขนาดอัตโนมัติแบบจำลองตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของเมตาบอไลต์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำนายมะเร็งต่อมลูกหมากถูกสร้างขึ้นโดยใช้การถดถอยโลจิสติกแบบไบนารีที่มีการหดตัวสัมบูรณ์น้อยที่สุดและตัวดำเนินการคัดเลือก (LASSO, R package v.4.1-3)ประสิทธิภาพของแบบจำลองจำแนกในชุดการตรวจจับและการตรวจสอบความถูกต้องมีลักษณะเฉพาะโดยการประมาณค่า AUC ตามการวิเคราะห์ ROC ตามแพ็คเกจ pROC (v.1.18.0.)ค่าตัดความน่าจะเป็นที่เหมาะสมที่สุดนั้นได้มาจากดัชนี Youden สูงสุดของแบบจำลอง (ความไว + ความจำเพาะ – 1)ตัวอย่างที่มีค่าน้อยกว่าหรือมากกว่าเกณฑ์จะถูกคาดการณ์ว่าเป็นก้อนที่ไม่ร้ายแรงและมะเร็งของต่อมในปอดตามลำดับ
เซลล์ A549 (#CCL-185, การรวบรวมการเพาะเลี้ยงชนิดอเมริกัน) ถูกทำให้เติบโตในตัวกลาง F-12K ที่มี 10% FBSลำดับ RNA ของกิ๊บสั้น (shRNA) ที่มุ่งเป้า SLC7A5 และส่วนควบคุมที่ไม่กำหนดเป้าหมาย (NC) ถูกแทรกเข้าไปในเวกเตอร์เลนติไวรัส pLKO.1-puroลำดับแอนติเจนของ shSLC7A5 มีดังนี้: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′)แอนติบอดีต่อ SLC7A5 (#5347) และทูบูลิน (#2148) ถูกซื้อจากเทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์แอนติบอดีต่อ SLC7A5 และทูบูลินถูกใช้ที่การเจือจางที่ 1:1000 สำหรับการวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อต
การทดสอบความเครียดไกลโคไลติกของ Seahorse XF วัดระดับความเป็นกรดนอกเซลล์ (ECAR)ในการสอบวิเคราะห์ กลูโคส, โอลิโกมัยซิน A และ 2-DG ถูกบริหารให้ตามลำดับเพื่อทดสอบความสามารถไกลโคไลติกของเซลล์ตามที่วัดโดย ECAR
เซลล์ A549 ที่ถูกทรานส์เฟกด้วยการควบคุมที่ไม่กำหนดเป้าหมาย (NC) และ shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ถูกชุบข้ามคืนในจานเส้นผ่านศูนย์กลาง 10 ซม.เมตาบอไลต์ของเซลล์ถูกสกัดด้วยเมทานอลที่เป็นน้ำ 80% เย็นใส่น้ำแข็ง 1 มิลลิลิตรเซลล์ในสารละลายเมทานอลถูกขูดออก, เก็บไปในหลอดใหม่ และปั่นแยกที่ 15,000 × กรัม เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4°Cเก็บส่วนลอยเหนือตะกอน 800 µl แล้วทำให้แห้งโดยใช้หัวสุญญากาศความเร็วสูงจากนั้นเม็ดเมตาบอไลต์แห้งถูกวิเคราะห์สำหรับระดับทริปโตเฟนโดยใช้ LC-MS/MS ตามที่อธิบายไว้ข้างต้นระดับ NAD(H) ของเซลลูลาร์ในเซลล์ A549 (NC และ shSLC7A5) ถูกวัดโดยใช้ชุดการวัดสี NAD+/NADH เชิงปริมาณ (#K337, BioVision) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตวัดระดับโปรตีนสำหรับแต่ละตัวอย่างเพื่อทำให้ปริมาณของสารเมตาบอไลต์เป็นปกติ
ไม่มีการใช้วิธีการทางสถิติเพื่อกำหนดขนาดตัวอย่างเบื้องต้นการศึกษาเมแทบอลิซึมก่อนหน้านี้ที่มุ่งเป้าไปที่การค้นพบตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ15,18 ได้รับการพิจารณาว่าเป็นเกณฑ์มาตรฐานสำหรับการกำหนดขนาด และเมื่อเปรียบเทียบกับรายงานเหล่านี้ ตัวอย่างของเราก็เพียงพอแล้วไม่มีการแยกตัวอย่างออกจากกลุ่มการศึกษาตัวอย่างเซรั่มได้รับการสุ่มให้กับกลุ่มการค้นพบ (306 ราย, 74.6%) และกลุ่มการตรวจสอบภายใน (104 ราย, 25.4%) สำหรับการศึกษาด้านเมแทบอลิซึมที่ไม่ตรงเป้าหมายนอกจากนี้เรายังสุ่มเลือก 70 กรณีจากแต่ละกลุ่มจากชุดการค้นพบสำหรับการศึกษาเมแทบอลิซึมแบบกำหนดเป้าหมายผู้วิจัยมองไม่เห็นการมอบหมายกลุ่มในระหว่างการรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูล LC-MSการวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูลเมแทบอลิซึมและการทดลองเซลล์มีการอธิบายไว้ในส่วนผลลัพธ์ คำอธิบายรูปภาพ และวิธีการที่เกี่ยวข้องการหาปริมาณของทริปโตเฟน, NADT และกิจกรรมไกลโคไลติกของเซลล์ถูกดำเนินการสามครั้งอย่างเป็นอิสระต่อกันด้วยผลลัพธ์ที่เหมือนกัน
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการศึกษา โปรดดูบทคัดย่อรายงาน Natural Portfolio ที่เกี่ยวข้องกับบทความนี้
ข้อมูล MS ดิบของคุณสมบัติที่แยกออกมาและข้อมูล MS ที่ทำให้เป็นมาตรฐานของซีรั่มอ้างอิงจะแสดงในข้อมูลเสริม 1 และข้อมูลเสริม 2 ตามลำดับคำอธิบายประกอบสูงสุดสำหรับคุณสมบัติที่แตกต่างแสดงอยู่ในข้อมูลเสริม 3 ชุดข้อมูล LUAD TCGA สามารถดาวน์โหลดได้จาก https://portal.gdc.cancer.gov/ข้อมูลอินพุตสำหรับการพล็อตกราฟมีอยู่ในข้อมูลต้นฉบับแหล่งข้อมูลมีให้สำหรับบทความนี้
กลุ่มศึกษาการตรวจคัดกรองปอดแห่งชาติ ฯลฯ การลดอัตราการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งปอดด้วยการตรวจเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ขนาดต่ำทางตอนเหนือของอังกฤษเจ.เมด.365, 395–409 (2011)
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR และ Prophet, PC การตรวจคัดกรองมะเร็งปอดโดยใช้ CT ลานขนาดต่ำ: ผลลัพธ์จากการศึกษาการตรวจคัดกรองปอดแห่งชาติ (NLST)เจ.เมด.หน้าจอ 18, 109–111 (2011)
เดอ โคนิง, HJ และคณะการลดการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งปอดด้วยการตรวจ CT ปริมาตรในการทดลองแบบสุ่มทางตอนเหนือของอังกฤษเจ.เมด.382, 503–513 (2020)