การวินิจฉัยแยกโรคของก้อนเนื้อในปอดที่ตรวจพบโดยการถ่ายภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ (CT) ยังคงเป็นความท้าทายในการปฏิบัติทางคลินิก ในที่นี้ เราได้ทำการวิเคราะห์ลักษณะเมตาโบไลต์โดยรวมของตัวอย่างซีรั่ม 480 ตัวอย่าง ซึ่งรวมถึงกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี ก้อนเนื้อในปอดชนิดไม่ร้ายแรง และมะเร็งปอดระยะที่ 1 มะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมามีลักษณะเมตาโบไลต์ที่เฉพาะเจาะจง ในขณะที่ก้อนเนื้อชนิดไม่ร้ายแรงและบุคคลที่มีสุขภาพดีมีลักษณะเมตาโบไลต์ที่คล้ายคลึงกันสูง ในกลุ่มการค้นพบ (n = 306) พบเมตาโบไลต์ 27 ชนิดที่สามารถแยกแยะระหว่างก้อนเนื้อชนิดไม่ร้ายแรงและก้อนเนื้อชนิดร้ายแรงได้ ค่า AUC ของแบบจำลองการจำแนกในกลุ่มการตรวจสอบภายใน (n = 104) และกลุ่มการตรวจสอบภายนอก (n = 111) คือ 0.915 และ 0.945 ตามลำดับ การวิเคราะห์เส้นทางชีวเคมีเผยให้เห็นว่าเมตาบอไลต์ไกลโคไลซิสที่เพิ่มขึ้นสัมพันธ์กับทริปโตเฟนที่ลดลงในซีรั่มของผู้ป่วยมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา เมื่อเทียบกับก้อนเนื้อที่ไม่เป็นมะเร็งและกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี และชี้ให้เห็นว่าการดูดซึมทริปโตเฟนส่งเสริมกระบวนการไกลโคไลซิสในเซลล์มะเร็งปอด การศึกษาของเราเน้นย้ำถึงคุณค่าของไบโอมาร์กเกอร์เมตาบอไลต์ในซีรั่มในการประเมินความเสี่ยงของก้อนเนื้อในปอดที่ตรวจพบโดย CT สแกน
การวินิจฉัยโรคในระยะเริ่มต้นมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการเพิ่มอัตราการรอดชีวิตของผู้ป่วยมะเร็ง ผลการศึกษาจากโครงการคัดกรองมะเร็งปอดแห่งชาติของสหรัฐอเมริกา (NLST) และการศึกษา NELSON ของยุโรปแสดงให้เห็นว่าการคัดกรองด้วยเอกซเรย์คอมพิวเตอร์แบบใช้ปริมาณรังสีต่ำ (LDCT) สามารถลดอัตราการเสียชีวิตจากมะเร็งปอดในกลุ่มเสี่ยงสูงได้อย่างมีนัยสำคัญ1,2,3 นับตั้งแต่มีการใช้ LDCT อย่างแพร่หลายในการคัดกรองมะเร็งปอด อุบัติการณ์ของการตรวจพบก้อนเนื้อในปอดโดยบังเอิญโดยไม่มีอาการก็เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง4 ก้อนเนื้อในปอดถูกกำหนดให้เป็นความทึบแสงเฉพาะจุดที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางไม่เกิน 3 ซม.5 เราเผชิญกับความยากลำบากในการประเมินความน่าจะเป็นของมะเร็งและการจัดการกับก้อนเนื้อในปอดจำนวนมากที่ตรวจพบโดยบังเอิญจาก LDCT ข้อจำกัดของ CT อาจนำไปสู่การตรวจติดตามบ่อยครั้งและผลลัพธ์ที่เป็นบวกเท็จ ซึ่งนำไปสู่การแทรกแซงที่ไม่จำเป็นและการรักษาเกินความจำเป็น6 ดังนั้น จึงมีความจำเป็นต้องพัฒนาไบโอมาร์กเกอร์ที่เชื่อถือได้และมีประโยชน์เพื่อระบุโรคมะเร็งปอดในระยะเริ่มต้นได้อย่างถูกต้อง และแยกแยะก้อนเนื้อที่ไม่เป็นอันตรายส่วนใหญ่ได้ตั้งแต่การตรวจพบครั้งแรก 7
การวิเคราะห์โมเลกุลอย่างครอบคลุมของเลือด (ซีรั่ม พลาสมา เซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดโมโนนิวเคลียร์ในเลือดส่วนปลาย) รวมถึงจีโนมิกส์ โปรตีโอมิกส์ หรือเมทิลเลชันของดีเอ็นเอ8,9,10 ทำให้เกิดความสนใจเพิ่มมากขึ้นในการค้นหาไบโอมาร์กเกอร์สำหรับการวินิจฉัยโรคมะเร็งปอด ในขณะเดียวกัน วิธีการเมตาโบโลมิกส์จะวัดผลิตภัณฑ์สุดท้ายของเซลล์ที่ได้รับอิทธิพลจากการกระทำภายในและภายนอกร่างกาย จึงถูกนำมาใช้ในการทำนายการเกิดโรคและผลลัพธ์ โครมาโทกราฟีของเหลวร่วมกับแมสสเปกโทรเมตรีแบบแทงเดม (LC-MS) เป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาเมตาโบโลมิกส์เนื่องจากมีความไวสูงและช่วงไดนามิกกว้าง ซึ่งสามารถครอบคลุมเมตาโบไลต์ที่มีคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีที่แตกต่างกัน11,12,13 แม้ว่าการวิเคราะห์เมตาโบโลมิกส์โดยรวมของพลาสมา/ซีรั่มจะถูกนำมาใช้เพื่อระบุไบโอมาร์กเกอร์ที่เกี่ยวข้องกับการวินิจฉัยโรคมะเร็งปอด14,15,16,17 และประสิทธิภาพการรักษา18 แต่ตัวจำแนกเมตาโบไลต์ในซีรั่มเพื่อแยกแยะระหว่างก้อนเนื้อปอดชนิดไม่ร้ายแรงและชนิดร้ายแรงยังคงต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมอีกมาก - การวิจัยจำนวนมาก
มะเร็งต่อมอะเดโนคาร์ซิโนมาและมะเร็งเซลล์สความัสเป็นมะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์ขนาดเล็ก (NSCLC) สองชนิดหลัก การตรวจคัดกรองด้วย CT หลายวิธีบ่งชี้ว่ามะเร็งต่อมอะเดโนคาร์ซิโนมาเป็นชนิดทางเนื้อเยื่อวิทยาที่พบได้บ่อยที่สุดของมะเร็งปอด1,19,20,21 ในการศึกษานี้ เราใช้เทคนิคโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงร่วมกับแมสสเปกโทรเมตรีความละเอียดสูง (UPLC-HRMS) เพื่อทำการวิเคราะห์เมตาโบลิกส์ในตัวอย่างซีรั่มทั้งหมด 695 ตัวอย่าง ซึ่งรวมถึงกลุ่มควบคุมสุขภาพดี ก้อนเนื้อปอดที่ไม่เป็นอันตราย และก้อนเนื้อปอดขนาด ≤3 ซม. ที่ตรวจพบด้วย CT เพื่อคัดกรองมะเร็งต่อมอะเดโนคาร์ซิโนมาปอดระยะที่ 1 เราได้ระบุกลุ่มของเมตาโบไลต์ในซีรั่มที่สามารถแยกแยะมะเร็งต่อมอะเดโนคาร์ซิโนมาปอดออกจากก้อนเนื้อที่ไม่เป็นอันตรายและกลุ่มควบคุมสุขภาพดี การวิเคราะห์การเสริมสร้างเส้นทางแสดงให้เห็นว่าการเผาผลาญทริปโตเฟนและกลูโคสที่ผิดปกติเป็นการเปลี่ยนแปลงที่พบได้ทั่วไปในมะเร็งต่อมอะเดโนคาร์ซิโนมาปอดเมื่อเทียบกับก้อนเนื้อที่ไม่เป็นอันตรายและกลุ่มควบคุมสุขภาพดี สุดท้ายนี้ เราได้สร้างและตรวจสอบความถูกต้องของตัวจำแนกการเผาผลาญในซีรั่มที่มีความจำเพาะและความไวสูงในการแยกแยะระหว่างก้อนเนื้อร้ายและก้อนเนื้อไม่ร้ายในปอดที่ตรวจพบโดย LDCT ซึ่งอาจช่วยในการวินิจฉัยแยกโรคและการประเมินความเสี่ยงในระยะเริ่มต้นได้
ในการศึกษาครั้งนี้ ได้มีการเก็บรวบรวมตัวอย่างซีรั่มย้อนหลังจากกลุ่มควบคุมสุขภาพดี 174 ราย ผู้ป่วยที่มีก้อนเนื้อในปอดชนิดไม่ร้ายแรง 292 ราย และผู้ป่วยมะเร็งปอดระยะที่ 1 จำนวน 229 ราย โดยจับคู่ตามเพศและอายุ ลักษณะทางประชากรของกลุ่มตัวอย่างทั้ง 695 รายแสดงอยู่ในตารางเสริมที่ 1
ดังแสดงในรูปที่ 1a ตัวอย่างซีรั่มทั้งหมด 480 ตัวอย่าง ประกอบด้วยตัวอย่างควบคุมสุขภาพดี (HC) 174 ตัวอย่าง ตัวอย่างก้อนเนื้อไม่ร้ายแรง (BN) 170 ตัวอย่าง และตัวอย่างมะเร็งปอดระยะที่ 1 (LA) 136 ตัวอย่าง ถูกเก็บรวบรวมที่ศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซน เพื่อใช้เป็นกลุ่มตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์เมตาโบลิกแบบไม่เจาะจงเป้าหมายโดยใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงร่วมกับแมสสเปกโทรเมตรีความละเอียดสูง (UPLC-HRMS) ดังแสดงในรูปเพิ่มเติมที่ 1 ได้มีการระบุเมตาโบไลต์ที่แตกต่างกันระหว่าง LA และ HC, LA และ BN เพื่อสร้างแบบจำลองการจำแนกประเภทและสำรวจการวิเคราะห์เส้นทางที่แตกต่างกันต่อไป ตัวอย่าง 104 ตัวอย่างที่เก็บรวบรวมโดยศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซน และตัวอย่าง 111 ตัวอย่างที่เก็บรวบรวมโดยโรงพยาบาลอีกสองแห่ง ได้รับการตรวจสอบความถูกต้องภายในและภายนอกตามลำดับ
a กลุ่มประชากรศึกษาในกลุ่มตัวอย่างการค้นพบที่ได้รับการวิเคราะห์เมตาโบลิกส์ในซีรั่มโดยรวมโดยใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง-แมสสเปกโทรเมตรีความละเอียดสูง (UPLC-HRMS) b การวิเคราะห์จำแนกความแตกต่างแบบกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน (PLS-DA) ของเมตาโบโลมทั้งหมดของตัวอย่างซีรั่ม 480 ตัวอย่างจากกลุ่มตัวอย่างการศึกษา ซึ่งรวมถึงกลุ่มควบคุมสุขภาพดี (HC, n = 174), ก้อนเนื้อที่ไม่เป็นอันตราย (BN, n = 170) และมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา ระยะที่ 1 (ลอสแอนเจลิส, n = 136) +ESI, โหมดการแตกตัวเป็นไอออนด้วยไฟฟ้าสเปรย์แบบบวก, -ESI, โหมดการแตกตัวเป็นไอออนด้วยไฟฟ้าสเปรย์แบบลบ c–e เมตาโบไลต์ที่มีปริมาณแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในสองกลุ่มที่กำหนด (การทดสอบ Wilcoxon signed rank แบบสองด้าน, ค่า p ที่ปรับด้วยอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด, FDR <0.05) แสดงด้วยสีแดง (การเปลี่ยนแปลงมากกว่า 1.2 เท่า) และสีน้ำเงิน (การเปลี่ยนแปลงน้อยกว่า 0.83 เท่า) แสดงในกราฟภูเขาไฟ f แผนภูมิความร้อนของการจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นที่แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในจำนวนเมตาโบไลต์ที่ระบุระหว่าง LA และ BN ข้อมูลต้นฉบับมีให้ในรูปแบบไฟล์ข้อมูลต้นฉบับ
มีการวิเคราะห์เมตาโบโลมในซีรั่มทั้งหมดของกลุ่ม HC จำนวน 174 คน, BN จำนวน 170 คน และ LA จำนวน 136 คน ในกลุ่มทดลองโดยใช้การวิเคราะห์ UPLC-HRMS เราแสดงให้เห็นก่อนว่าตัวอย่างควบคุมคุณภาพ (QC) รวมกลุ่มกันอย่างแน่นหนาที่จุดศูนย์กลางของแบบจำลองการวิเคราะห์องค์ประกอบหลักแบบไม่กำกับดูแล (PCA) ซึ่งยืนยันความเสถียรของประสิทธิภาพการศึกษาในปัจจุบัน (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 2)
ดังแสดงในผลการวิเคราะห์จำแนกความแตกต่างแบบกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน (PLS-DA) ในรูปที่ 1b เราพบว่ามีความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่าง LA และ BN รวมถึง LA และ HC ในโหมดการแตกตัวเป็นไอออนด้วยไฟฟ้าสเปรย์แบบบวก (+ESI) และลบ (−ESI) อย่างไรก็ตาม ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง BN และ HC ในสภาวะ +ESI และ -ESI
เราพบคุณลักษณะที่แตกต่างกัน 382 รายการระหว่าง LA และ HC, 231 รายการระหว่าง LA และ BN และ 95 รายการระหว่าง BN และ HC (การทดสอบ Wilcoxon signed rank, FDR <0.05 และการเปลี่ยนแปลงหลายรายการ >1.2 หรือ <0.83) (รูปที่ 1c-e) นอกจากนี้ ยังมีการระบุพีคเพิ่มเติม (ข้อมูลเสริม 3) โดยเทียบกับฐานข้อมูล (mzCloud/HMDB/Chemspider library) โดยใช้ค่า m/z, เวลาการเก็บรักษา และการค้นหาสเปกตรัมมวลแบบแตกตัว (รายละเอียดอยู่ในส่วนวิธีการ) 22 สุดท้ายนี้ พบเมตาบอไลต์ที่ระบุได้ 33 และ 38 รายการที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณระหว่าง LA กับ BN (รูปที่ 1f และตารางเสริม 2) และ LA กับ HC (รูปเสริม 3 และตารางเสริม 2) ตามลำดับ ในทางตรงกันข้าม พบเมตาโบไลต์เพียง 3 ชนิดที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณระหว่าง BN และ HC (ตารางเสริม 2) ซึ่งสอดคล้องกับการทับซ้อนกันระหว่าง BN และ HC ใน PLS-DA เมตาโบไลต์ที่แตกต่างกันเหล่านี้ครอบคลุมสารชีวเคมีหลากหลายชนิด (ภาพเสริม 4) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในเมตาโบโลมของซีรั่มที่สะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงไปสู่มะเร็งในระยะเริ่มต้นของมะเร็งปอด เมื่อเทียบกับก้อนเนื้อปอดที่ไม่เป็นมะเร็งหรือผู้ที่มีสุขภาพดี ในขณะเดียวกัน ความคล้ายคลึงกันของเมตาโบโลมของซีรั่มของ BN และ HC ชี้ให้เห็นว่าก้อนเนื้อปอดที่ไม่เป็นมะเร็งอาจมีลักษณะทางชีวภาพหลายอย่างร่วมกับบุคคลที่มีสุขภาพดี เนื่องจากพบว่าการกลายพันธุ์ของยีนตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนัง (EGFR) เป็นเรื่องปกติในมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมาชนิดย่อย 23 เราจึงพยายามตรวจสอบผลกระทบของการกลายพันธุ์ที่เป็นตัวขับเคลื่อนต่อเมตาโบโลมของซีรั่ม จากนั้นเราได้วิเคราะห์โปรไฟล์เมตาโบโลมโดยรวมของ 72 กรณีที่มีสถานะ EGFR ในกลุ่มมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา ที่น่าสนใจคือ เราพบโปรไฟล์ที่คล้ายคลึงกันระหว่างผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ของ EGFR (n = 41) และผู้ป่วยที่มี EGFR ชนิดปกติ (n = 31) ในการวิเคราะห์ PCA (ภาพประกอบเพิ่มเติม 5a) อย่างไรก็ตาม เราพบเมตาบอไลต์ 7 ชนิดที่มีปริมาณเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ของ EGFR เมื่อเทียบกับผู้ป่วยที่มี EGFR ชนิดปกติ (การทดสอบ t, p < 0.05 และการเปลี่ยนแปลงมากกว่า 1.2 หรือน้อยกว่า 0.83) (ภาพประกอบเพิ่มเติม 5b) เมตาบอไลต์ส่วนใหญ่เหล่านี้ (5 ใน 7 ชนิด) เป็นอะซิลคาร์นิทีน ซึ่งมีบทบาทสำคัญในกระบวนการออกซิเดชันของกรดไขมัน
ดังแสดงในขั้นตอนการทำงานในรูปที่ 2a ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพสำหรับการจำแนกประเภทของก้อนเนื้อได้มาจากการใช้ตัวดำเนินการลดขนาดสัมบูรณ์น้อยที่สุด (Least Absolute Shrinkage Operators) และการเลือกโดยอิงจากเมตาโบไลต์ที่แตกต่างกัน 33 ชนิดที่ระบุใน LA (n = 136) และ BN (n = 170) การรวมตัวแปรที่ดีที่สุด (LASSO) – แบบจำลองการถดถอยโลจิสติกแบบไบนารี ใช้การตรวจสอบแบบไขว้ 10 เท่า (ten-fold cross-validation) เพื่อทดสอบความน่าเชื่อถือของแบบจำลอง การเลือกตัวแปรและการปรับค่าพารามิเตอร์จะถูกปรับโดยการลงโทษการเพิ่มความน่าจะเป็นสูงสุดด้วยพารามิเตอร์ λ24 การวิเคราะห์เมตาโบลิกส์ทั่วโลกดำเนินการอย่างอิสระในกลุ่มการตรวจสอบภายใน (n = 104) และกลุ่มการตรวจสอบภายนอก (n = 111) เพื่อทดสอบประสิทธิภาพการจำแนกประเภทของแบบจำลองการจำแนก ผลลัพธ์ที่ได้คือ เมตาโบไลต์ 27 ชนิดในชุดการค้นพบถูกระบุว่าเป็นแบบจำลองการจำแนกที่ดีที่สุดด้วยค่า AUC เฉลี่ยสูงสุด (รูปที่ 2b) ซึ่งในจำนวนนี้ 9 ชนิดมีกิจกรรมเพิ่มขึ้นและ 18 ชนิดมีกิจกรรมลดลงใน LA เมื่อเทียบกับ BN (รูปที่ 2c)
a. ขั้นตอนการสร้างตัวจำแนกก้อนเนื้อในปอด รวมถึงการเลือกกลุ่มเมตาโบไลต์ในซีรั่มที่ดีที่สุดในชุดการค้นพบโดยใช้แบบจำลองการถดถอยโลจิสติกแบบไบนารีผ่านการตรวจสอบแบบไขว้ 10 เท่า และการประเมินประสิทธิภาพการทำนายในชุดการตรวจสอบภายในและภายนอก b. สถิติการตรวจสอบแบบไขว้ของแบบจำลองการถดถอย LASSO สำหรับการเลือกไบโอมาร์กเกอร์เมตาโบลิก ตัวเลขที่แสดงด้านบนแสดงถึงจำนวนเฉลี่ยของไบโอมาร์กเกอร์ที่เลือกที่ค่า λ ที่กำหนด เส้นประสีแดงแสดงถึงค่า AUC เฉลี่ยที่ค่าแลมบ์ดาที่สอดคล้องกัน แถบข้อผิดพลาดสีเทาแสดงถึงค่า AUC ต่ำสุดและสูงสุด เส้นประแสดงถึงแบบจำลองที่ดีที่สุดที่มีไบโอมาร์กเกอร์ที่เลือก 27 ตัว AUC คือพื้นที่ใต้เส้นโค้งลักษณะการทำงานของผู้รับ (ROC) c. การเปลี่ยนแปลงของเมตาโบไลต์ที่เลือก 27 ตัวในกลุ่ม LA เมื่อเทียบกับกลุ่ม BN ในกลุ่มการค้นพบ คอลัมน์สีแดงแสดงถึงการกระตุ้น คอลัมน์สีน้ำเงินแสดงถึงการลดลง d–f เส้นโค้งลักษณะการทำงานของผู้รับ (ROC) แสดงประสิทธิภาพของแบบจำลองจำแนกประเภทโดยอิงจากชุดเมตาโบไลต์ 27 ชุด ในชุดการค้นพบ ชุดการตรวจสอบภายใน และชุดการตรวจสอบภายนอก ข้อมูลต้นฉบับมีให้ในรูปแบบไฟล์ข้อมูลต้นฉบับ
ได้มีการสร้างแบบจำลองการทำนายโดยอิงจากสัมประสิทธิ์การถดถอยแบบถ่วงน้ำหนักของสารเมตาบอไลต์ทั้ง 27 ชนิดนี้ (ตารางเสริม 3) การวิเคราะห์ ROC โดยใช้สารเมตาบอไลต์ทั้ง 27 ชนิดนี้ให้ค่าพื้นที่ใต้เส้นโค้ง (AUC) เท่ากับ 0.933 ความไวของกลุ่มที่ค้นพบเท่ากับ 0.868 และความจำเพาะเท่ากับ 0.859 (รูปที่ 2d) ในขณะเดียวกัน ในบรรดาสารเมตาบอไลต์ที่แตกต่างกัน 38 ชนิดระหว่าง LA และ HC ชุดของสารเมตาบอไลต์ 16 ชนิดให้ค่า AUC เท่ากับ 0.902 โดยมีความไวเท่ากับ 0.801 และความจำเพาะเท่ากับ 0.856 ในการจำแนก LA จาก HC (รูปเสริม 6a-c) นอกจากนี้ยังได้เปรียบเทียบค่า AUC โดยอิงจากเกณฑ์การเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัวที่แตกต่างกันสำหรับสารเมตาบอไลต์ที่แตกต่างกันด้วย เราพบว่าแบบจำลองการจำแนกประเภททำงานได้ดีที่สุดในการแยกแยะระหว่าง LA และ BN (HC) เมื่อตั้งค่าระดับการเปลี่ยนแปลงเป็น 1.2 เทียบกับ 1.5 หรือ 2.0 (ภาพประกอบเพิ่มเติม 7a,b) แบบจำลองการจำแนกประเภทซึ่งอิงตามกลุ่มเมตาโบไลต์ 27 กลุ่ม ได้รับการตรวจสอบความถูกต้องเพิ่มเติมในกลุ่มตัวอย่างภายในและภายนอก ค่า AUC อยู่ที่ 0.915 (ความไว 0.867 ความจำเพาะ 0.811) สำหรับการตรวจสอบความถูกต้องภายใน และ 0.945 (ความไว 0.810 ความจำเพาะ 0.979) สำหรับการตรวจสอบความถูกต้องภายนอก (รูปที่ 2e, f) เพื่อประเมินประสิทธิภาพระหว่างห้องปฏิบัติการ ตัวอย่าง 40 ตัวอย่างจากกลุ่มตัวอย่างภายนอกได้รับการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการภายนอกตามที่อธิบายไว้ในส่วนวิธีการ ความแม่นยำในการจำแนกประเภทได้ค่า AUC เท่ากับ 0.925 (ภาพประกอบเพิ่มเติม 8) เนื่องจากมะเร็งปอดชนิดเซลล์สความัส (LUSC) เป็นชนิดย่อยที่พบมากเป็นอันดับสองของมะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์ขนาดเล็ก (NSCLC) รองจากมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา (LUAD) เราจึงได้ทดสอบประโยชน์ที่เป็นไปได้ของข้อมูลเมตาบอลิซึมที่ได้รับการตรวจสอบแล้วในผู้ป่วย BN จำนวน 16 รายที่เป็น LUSC ค่า AUC ของการจำแนกความแตกต่างระหว่าง LUSC และ BN คือ 0.776 (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 9) ซึ่งบ่งชี้ว่าความสามารถในการจำแนกความแตกต่างนั้นด้อยกว่าเมื่อเทียบกับการจำแนกความแตกต่างระหว่าง LUAD และ BN
การศึกษาต่างๆ แสดงให้เห็นว่าขนาดของก้อนเนื้อในภาพ CT มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับโอกาสที่จะเป็นมะเร็ง และยังคงเป็นปัจจัยสำคัญในการรักษาก้อนเนื้อ25,26,27 การวิเคราะห์ข้อมูลจากกลุ่มตัวอย่างขนาดใหญ่ของการศึกษาคัดกรอง NELSON แสดงให้เห็นว่าความเสี่ยงของการเกิดมะเร็งในผู้ที่มีก้อนเนื้อขนาด <5 มม. นั้นใกล้เคียงกับผู้ที่ไม่มีก้อนเนื้อ 28 ดังนั้น ขนาดขั้นต่ำที่ต้องมีการตรวจติดตามด้วย CT เป็นประจำคือ 5 มม. ตามที่ British Thoracic Society (BTS) แนะนำ และ 6 มม. ตามที่ Fleischner Society แนะนำ 29 อย่างไรก็ตาม ก้อนเนื้อที่มีขนาดใหญ่กว่า 6 มม. และไม่มีลักษณะที่ไม่เป็นอันตรายอย่างชัดเจน เรียกว่า ก้อนเนื้อปอดที่ไม่สามารถระบุได้ (IPN) ยังคงเป็นความท้าทายสำคัญในการประเมินและการจัดการในทางคลินิก30,31 ต่อไปเราได้ตรวจสอบว่าขนาดของก้อนเนื้อมีอิทธิพลต่อลักษณะเฉพาะของเมตาโบลิกหรือไม่ โดยใช้ตัวอย่างรวมจากกลุ่มตัวอย่างการค้นพบและการตรวจสอบภายใน โดยมุ่งเน้นที่ไบโอมาร์กเกอร์ที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว 27 ตัว เราได้เปรียบเทียบโปรไฟล์ PCA ของเมตาโบโลม HC และ BN ที่มีขนาดเล็กกว่า 6 มม. ก่อน เราพบว่าจุดข้อมูลส่วนใหญ่ของ HC และ BN ซ้อนทับกัน ซึ่งแสดงให้เห็นว่าระดับเมตาโบไลต์ในซีรั่มนั้นคล้ายคลึงกันในทั้งสองกลุ่ม (รูปที่ 3a) แผนที่คุณลักษณะในช่วงขนาดต่างๆ ยังคงเหมือนเดิมใน BN และ LA (รูปที่ 3b, c) ในขณะที่สังเกตเห็นการแยกตัวระหว่างก้อนเนื้อร้ายและก้อนเนื้อไม่ร้ายในช่วงขนาด 6–20 มม. (รูปที่ 3d) กลุ่มตัวอย่างนี้มีค่า AUC 0.927 ความจำเพาะ 0.868 และความไว 0.820 สำหรับการทำนายความร้ายแรงของก้อนเนื้อที่มีขนาด 6 ถึง 20 มม. (รูปที่ 3e, f) ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าตัวจำแนกสามารถจับการเปลี่ยนแปลงทางเมตาโบลิกที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงไปเป็นมะเร็งในระยะเริ่มต้นได้ โดยไม่คำนึงถึงขนาดของก้อนเนื้อ
ad การเปรียบเทียบโปรไฟล์ PCA ระหว่างกลุ่มที่กำหนดโดยใช้ตัวจำแนกเมตาบอลิซึมของเมตาบอไลต์ 27 ชนิด CC และ BN < 6 มม. b BN < 6 มม. เทียบกับ BN 6–20 มม. ใน LA 6–20 มม. เทียบกับ LA 20–30 มม. g BN 6–20 มม. และ LA 6–20 มม. GC, n = 174; BN < 6 มม., n = 153; BN 6–20 มม., n = 91; LA 6–20 มม., n = 89; LA 20–30 มม., n = 77 e เส้นโค้งลักษณะการทำงานของผู้รับ (ROC) แสดงประสิทธิภาพของแบบจำลองการจำแนกสำหรับก้อนเนื้อขนาด 6–20 มม. f ค่าความน่าจะเป็นคำนวณจากแบบจำลองการถดถอยโลจิสติกสำหรับก้อนเนื้อขนาด 6–20 มม. เส้นประสีเทาแสดงค่าตัดที่เหมาะสมที่สุด (0.455) ตัวเลขข้างต้นแสดงถึงเปอร์เซ็นต์ของกรณีที่คาดการณ์ไว้สำหรับลอสแอนเจลิส ใช้การทดสอบ t ของนักเรียนแบบสองด้าน PCA คือ การวิเคราะห์ส่วนประกอบหลัก AUC คือ พื้นที่ใต้เส้นโค้ง ข้อมูลต้นฉบับมีให้ในรูปแบบไฟล์ข้อมูลต้นฉบับ
ได้คัดเลือกตัวอย่างเพิ่มเติมอีก 4 ตัวอย่าง (อายุ 44–61 ปี) ที่มีขนาดก้อนเนื้อในปอดใกล้เคียงกัน (7–9 มม.) เพื่อแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของแบบจำลองการทำนายมะเร็งที่เสนอ (รูปที่ 4a, b) ในการตรวจคัดกรองเบื้องต้น กรณีที่ 1 พบว่าเป็นก้อนเนื้อแข็งที่มีแคลซิฟิเคชั่น ซึ่งเป็นลักษณะที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกที่ไม่ร้ายแรง ในขณะที่กรณีที่ 2 พบว่าเป็นก้อนเนื้อที่ไม่สามารถระบุได้แน่ชัด มีลักษณะกึ่งแข็งกึ่งทึบ และไม่มีลักษณะที่ไม่ร้ายแรงอย่างชัดเจน การตรวจ CT สแกนติดตามผล 3 รอบ แสดงให้เห็นว่ากรณีเหล่านี้ยังคงมีเสถียรภาพตลอดระยะเวลา 4 ปี ดังนั้นจึงถือว่าเป็นก้อนเนื้อที่ไม่ร้ายแรง (รูปที่ 4a) เมื่อเปรียบเทียบกับการประเมินทางคลินิกจากการตรวจ CT สแกนแบบต่อเนื่อง การวิเคราะห์เมตาโบไลต์ในซีรั่มแบบครั้งเดียวด้วยแบบจำลองการจำแนกประเภทปัจจุบัน สามารถระบุเนื้องอกที่ไม่ร้ายแรงเหล่านี้ได้อย่างรวดเร็วและถูกต้อง โดยอาศัยข้อจำกัดเชิงความน่าจะเป็น (ตารางที่ 1) รูปที่ 4b ในกรณีที่ 3 แสดงให้เห็นก้อนเนื้อที่มีสัญญาณของการหดตัวของเยื่อหุ้มปอด ซึ่งมักเกี่ยวข้องกับมะเร็ง32 กรณีที่ 4 มีลักษณะเป็นก้อนเนื้อที่ไม่สามารถระบุชนิดได้แน่ชัด มีลักษณะเป็นก้อนเนื้อแข็งบางส่วน และไม่มีหลักฐานบ่งชี้ถึงสาเหตุที่ไม่ร้ายแรง กรณีทั้งหมดนี้ถูกทำนายว่าเป็นมะเร็งตามแบบจำลองการจำแนกประเภท (ตารางที่ 1) การประเมินมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมาได้รับการยืนยันโดยการตรวจทางพยาธิวิทยาหลังการผ่าตัดปอด (รูปที่ 4b) สำหรับชุดข้อมูลการตรวจสอบภายนอก ตัวจำแนกประเภทเมตาบอลิซึมสามารถทำนายกรณีที่มีก้อนเนื้อในปอดที่ไม่สามารถระบุชนิดได้แน่ชัดขนาดใหญ่กว่า 6 มม. ได้อย่างแม่นยำ 2 กรณี (รูปภาพเพิ่มเติมที่ 10)
ภาพ CT สแกนปอดในแนวแกนของสองกรณีที่มีก้อนเนื้อไม่ร้ายแรง ในกรณีที่ 1 การสแกน CT หลังจาก 4 ปี แสดงให้เห็นก้อนเนื้อแข็งคงที่ขนาด 7 มม. พร้อมแคลซิฟิเคชั่นในกลีบปอดล่างขวา ในกรณีที่ 2 การสแกน CT หลังจาก 5 ปี เผยให้เห็นก้อนเนื้อแข็งบางส่วนคงที่ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 7 มม. ในกลีบปอดบนขวา b ภาพ CT สแกนปอดในแนวแกนและการศึกษาทางพยาธิวิทยาที่เกี่ยวข้องของสองกรณีของมะเร็งต่อมอะเดโนคาร์ซิโนมาในระยะที่ 1 ก่อนการผ่าตัดปอด กรณีที่ 3 เผยให้เห็นก้อนเนื้อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 8 มม. ในกลีบปอดบนขวาพร้อมการหดตัวของเยื่อหุ้มปอด กรณีที่ 4 เผยให้เห็นก้อนเนื้อแข็งบางส่วนแบบกระจกฝ้าขนาด 9 มม. ในกลีบปอดบนซ้าย การย้อมสีฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E) ของเนื้อเยื่อปอดที่ตัดออก (แถบมาตราส่วน = 50 μm) แสดงให้เห็นรูปแบบการเจริญเติบโตแบบอะซินาร์ของมะเร็งต่อมอะเดโนคาร์ซิโนมาของปอด ลูกศรชี้ไปยังก้อนเนื้อที่ตรวจพบในภาพ CT ภาพ H&E เป็นภาพตัวอย่างจากหลายๆ บริเวณ (>3) บริเวณที่พยาธิแพทย์ตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์
โดยสรุป ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นถึงคุณค่าที่เป็นไปได้ของไบโอมาร์กเกอร์เมตาโบไลต์ในซีรั่มในการวินิจฉัยแยกโรคของก้อนเนื้อในปอด ซึ่งอาจเป็นอุปสรรคในการประเมินผลการตรวจคัดกรองด้วย CT สแกน
จากการใช้แผงเมตาโบไลต์ที่แตกต่างกันซึ่งได้รับการตรวจสอบแล้ว เราพยายามระบุความสัมพันธ์ทางชีวภาพของการเปลี่ยนแปลงเมตาโบลิซึมที่สำคัญ การวิเคราะห์การเสริมคุณค่าของวิถี KEGG โดย MetaboAnalyst ระบุวิถีที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญร่วมกัน 6 วิถีระหว่างสองกลุ่มที่กำหนด (LA เทียบกับ HC และ LA เทียบกับ BN, ค่า p ที่ปรับแล้ว ≤ 0.001, ผลกระทบ > 0.01) การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้มีลักษณะเป็นการรบกวนในเมตาโบลิซึมของไพรูเวต เมตาโบลิซึมของทริปโตเฟน เมตาโบลิซึมของไนอะซินและนิโคตินาไมด์ ไกลโคไลซิส วงจร TCA และเมตาโบลิซึมของพิวรีน (รูปที่ 5a) จากนั้นเราได้ทำการวิเคราะห์เมตาโบลิซึมแบบกำหนดเป้าหมายเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญโดยใช้การหาปริมาณสัมบูรณ์ การกำหนดเมตาโบไลต์ทั่วไปในวิถีที่เปลี่ยนแปลงร่วมกันโดยใช้เครื่องแมสสเปกโทรเมตรีแบบควอดรูโพลสามตัว (QQQ) โดยใช้มาตรฐานเมตาโบไลต์แท้ ลักษณะทางประชากรศาสตร์ของกลุ่มตัวอย่างเป้าหมายในการศึกษาเมตาโบลิกส์แสดงอยู่ในตารางเสริมที่ 4 สอดคล้องกับผลลัพธ์เมตาโบลิกส์โดยรวมของเรา การวิเคราะห์เชิงปริมาณยืนยันว่าไฮโปแซนทีนและแซนทีน ไพรูเวท และแลคเตทเพิ่มขึ้นในกลุ่ม LA เมื่อเทียบกับกลุ่ม BN และ HC (รูปที่ 5b, c, p <0.05) อย่างไรก็ตาม ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในเมตาโบไลต์เหล่านี้ระหว่างกลุ่ม BN และ HC
การวิเคราะห์การเสริมคุณค่าของวิถี KEGG ของเมตาบอไลต์ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม LA เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม BN และ HC ใช้การทดสอบ Globaltest แบบสองด้าน และค่า p ถูกปรับโดยใช้วิธี Holm-Bonferroni (p ที่ปรับแล้ว ≤ 0.001 และขนาดผลกระทบ > 0.01) b–d แผนภาพไวโอลินแสดงระดับไฮโปแซนทีน แซนทีน แลคเตท ไพรูเวท และทริปโตเฟนในซีรั่ม HC, BN และ LA ที่ตรวจวัดโดย LC-MS/MS (n = 70 ต่อกลุ่ม) เส้นประสีขาวและสีดำแสดงค่ามัธยฐานและควอไทล์ตามลำดับ e แผนภาพไวโอลินแสดงการแสดงออกของ mRNA แบบ Log2TPM (transcripts per million) ที่ปรับให้เป็นมาตรฐานของ SLC7A5 และ QPRT ในมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา (n = 513) เมื่อเปรียบเทียบกับเนื้อเยื่อปอดปกติ (n = 59) ในชุดข้อมูล LUAD-TCGA กรอบสีขาวแสดงช่วงควาร์ไทล์ เส้นสีดำแนวนอนตรงกลางแสดงค่ามัธยฐาน และเส้นสีดำแนวตั้งที่ลากจากกรอบแสดงช่วงความเชื่อมั่น 95% (CI) f แผนภาพสหสัมพันธ์เพียร์สันของการแสดงออกของ SLC7A5 และ GAPDH ในมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา (n = 513) และเนื้อเยื่อปอดปกติ (n = 59) ในชุดข้อมูล TCGA พื้นที่สีเทาแสดงช่วงความเชื่อมั่น 95% r สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สัน g ระดับทริปโตเฟนในเซลล์ A549 ที่ได้รับการถ่ายยีนด้วย shRNA ควบคุมที่ไม่จำเพาะ (NC) และ shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ที่ได้รับการปรับค่ามาตรฐานโดย LC-MS/MS นำเสนอการวิเคราะห์ทางสถิติของตัวอย่างอิสระทางชีวภาพ 5 ตัวอย่างในแต่ละกลุ่ม h ระดับ NADt ในเซลล์ (NAD ทั้งหมด รวมถึง NAD+ และ NADH) ในเซลล์ A549 (NC) และเซลล์ A549 ที่ลดระดับ SLC7A5 (Sh1, Sh2) นำเสนอการวิเคราะห์ทางสถิติของตัวอย่างอิสระทางชีวภาพ 3 ตัวอย่างในแต่ละกลุ่ม i กิจกรรมไกลโคไลซิสของเซลล์ A549 ก่อนและหลังการลดระดับ SLC7A5 วัดโดยอัตราการเกิดกรดนอกเซลล์ (ECAR) (n = 4 ตัวอย่างอิสระทางชีวภาพต่อกลุ่ม) 2-DG,2-deoxy-D-glucose ใช้การทดสอบ t ของ Student แบบสองด้านใน (b–h) ใน (g–i) แถบแสดงข้อผิดพลาดแสดงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการอย่างอิสระ 3 ครั้งและผลลัพธ์คล้ายคลึงกัน ข้อมูลต้นฉบับมีให้ในรูปแบบไฟล์ข้อมูลต้นฉบับ
เมื่อพิจารณาถึงผลกระทบที่สำคัญของการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญทริปโตเฟนในกลุ่ม LA เราจึงประเมินระดับทริปโตเฟนในซีรั่มของกลุ่ม HC, BN และ LA โดยใช้ QQQ เราพบว่าระดับทริปโตเฟนในซีรั่มลดลงในกลุ่ม LA เมื่อเทียบกับกลุ่ม HC หรือ BN (p < 0.001, รูปที่ 5d) ซึ่งสอดคล้องกับผลการศึกษาที่ผ่านมาที่พบว่าระดับทริปโตเฟนในกระแสเลือดต่ำกว่าในผู้ป่วยมะเร็งปอดเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี33,34,35 การศึกษาอีกชิ้นหนึ่งที่ใช้สารติดตาม PET/CT 11C-methyl-L-tryptophan พบว่าเวลาการคงอยู่ของสัญญาณทริปโตเฟนในเนื้อเยื่อมะเร็งปอดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับรอยโรคที่ไม่ร้ายแรงหรือเนื้อเยื่อปกติ36 เราตั้งสมมติฐานว่าการลดลงของทริปโตเฟนในซีรั่มของกลุ่ม LA อาจสะท้อนถึงการดูดซึมทริปโตเฟนอย่างแข็งขันโดยเซลล์มะเร็งปอด
เป็นที่ทราบกันดีว่าผลิตภัณฑ์สุดท้ายของวิถีคีนูเรนีนของการสลายทริปโตเฟนคือ NAD+37,38 ซึ่งเป็นสารตั้งต้นที่สำคัญสำหรับปฏิกิริยาของกลีเซอรัลดีไฮด์-3-ฟอสเฟตกับ 1,3-บิสฟอสโฟกลีเซอเรตในไกลโคไลซิส39 ในขณะที่การศึกษาก่อนหน้านี้มุ่งเน้นไปที่บทบาทของการสลายทริปโตเฟนในการควบคุมภูมิคุ้มกัน เราจึงพยายามที่จะชี้แจงปฏิสัมพันธ์ระหว่างความผิดปกติของทริปโตเฟนและวิถีไกลโคไลซิสที่สังเกตได้ในการศึกษาปัจจุบัน โซลูตทรานสปอร์เตอร์แฟมิลี 7 สมาชิก 5 (SLC7A5) เป็นที่รู้จักกันว่าเป็นทรานสปอร์เตอร์ทริปโตเฟน43,44,45 ควินอลินิกแอซิดฟอสโฟริโบซิลทรานสเฟอเรส (QPRT) เป็นเอนไซม์ที่อยู่ปลายน้ำของวิถีคีนูเรนีนซึ่งแปลงกรดควินอลินิกเป็น NAMN46 จากการตรวจสอบชุดข้อมูล LUAD TCGA พบว่าทั้ง SLC7A5 และ QPRT มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อเนื้องอกเมื่อเทียบกับเนื้อเยื่อปกติ (รูปที่ 5e) การเพิ่มขึ้นนี้พบในระยะที่ 1 และ 2 เช่นเดียวกับระยะที่ 3 และ 4 ของมะเร็งต่อมอะเดโนคาร์ซิโนมาของปอด (รูปภาพเสริมที่ 11) ซึ่งบ่งชี้ถึงความผิดปกติในระยะเริ่มต้นของการเผาผลาญทริปโตเฟนที่เกี่ยวข้องกับการเกิดเนื้องอก
นอกจากนี้ ชุดข้อมูล LUAD-TCGA ยังแสดงให้เห็นความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างการแสดงออกของ mRNA ของ SLC7A5 และ GAPDH ในตัวอย่างผู้ป่วยมะเร็ง (r = 0.45, p = 1.55E-26, รูปที่ 5f) ในทางตรงกันข้าม ไม่พบความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญระหว่างลายเซ็นยีนดังกล่าวในเนื้อเยื่อปอดปกติ (r = 0.25, p = 0.06, รูปที่ 5f) การลดระดับ SLC7A5 (รูปภาพเสริม 12) ในเซลล์ A549 ทำให้ระดับทริปโตเฟนและ NAD(H) ในเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5g,h) ส่งผลให้กิจกรรมไกลโคไลซิสลดลงตามที่วัดได้จากอัตราการเกิดกรดนอกเซลล์ (ECAR) (รูปที่ 1) 5i) ดังนั้น จากการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมในซีรั่มและการตรวจจับในหลอดทดลอง เราจึงตั้งสมมติฐานว่าการเผาผลาญทริปโตเฟนอาจสร้าง NAD+ ผ่านทางวิถีคีนูเรนีนและมีบทบาทสำคัญในการส่งเสริมไกลโคไลซิสในมะเร็งปอด
จากการศึกษาพบว่า ก้อนเนื้อในปอดจำนวนมากที่ไม่สามารถระบุชนิดได้แน่ชัดซึ่งตรวจพบโดย LDCT อาจนำไปสู่ความจำเป็นในการตรวจเพิ่มเติม เช่น PET-CT การตรวจชิ้นเนื้อปอด และการรักษาเกินความจำเป็นเนื่องจากการวินิจฉัยผิดพลาดว่าเป็นมะเร็ง31 ดังแสดงในรูปที่ 6 การศึกษาของเราได้ระบุกลุ่มของสารเมตาบอไลต์ในซีรั่มที่มีศักยภาพในการวินิจฉัย ซึ่งอาจช่วยปรับปรุงการแบ่งระดับความเสี่ยงและการจัดการก้อนเนื้อในปอดที่ตรวจพบโดย CT ได้
การตรวจก้อนเนื้อในปอดทำได้โดยใช้เอกซเรย์คอมพิวเตอร์แบบใช้ปริมาณรังสีต่ำ (LDCT) โดยพิจารณาจากลักษณะภาพที่บ่งชี้ถึงสาเหตุที่อาจเป็นเนื้องอกชนิดไม่ร้ายแรงหรือร้ายแรง ผลลัพธ์ที่ไม่แน่นอนของการตรวจก้อนเนื้ออาจนำไปสู่การติดตามผลบ่อยครั้ง การแทรกแซงที่ไม่จำเป็น และการรักษาเกินความจำเป็น การรวมตัวบ่งชี้การเผาผลาญในซีรั่มที่มีคุณค่าในการวินิจฉัยอาจช่วยปรับปรุงการประเมินความเสี่ยงและการจัดการก้อนเนื้อในปอดในภายหลังได้ PET คือ การตรวจเอกซเรย์คอมพิวเตอร์แบบโพซิตรอน
ข้อมูลจากการศึกษา NLST ของสหรัฐอเมริกาและการศึกษา NELSON ของยุโรปชี้ให้เห็นว่าการตรวจคัดกรองกลุ่มเสี่ยงสูงด้วยเอกซเรย์คอมพิวเตอร์แบบใช้ปริมาณรังสีต่ำ (LDCT) อาจช่วยลดอัตราการเสียชีวิตจากมะเร็งปอดได้1,3 อย่างไรก็ตาม การประเมินความเสี่ยงและการจัดการทางคลินิกของก้อนเนื้อในปอดจำนวนมากที่ตรวจพบโดยบังเอิญด้วย LDCT ยังคงเป็นสิ่งที่ท้าทายที่สุด เป้าหมายหลักคือการเพิ่มประสิทธิภาพการจำแนกประเภทที่ถูกต้องของโปรโตคอล LDCT ที่มีอยู่โดยการรวมเอาตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่เชื่อถือได้เข้าไปด้วย
มีการระบุไบโอมาร์กเกอร์ระดับโมเลกุลบางชนิด เช่น เมตาโบไลต์ในเลือด โดยการเปรียบเทียบมะเร็งปอดกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี15,17 ในการศึกษาครั้งนี้ เรามุ่งเน้นไปที่การประยุกต์ใช้การวิเคราะห์เมตาโบโลมิกส์ในซีรั่มเพื่อแยกแยะระหว่างก้อนเนื้อปอดชนิดไม่ร้ายแรงและชนิดร้ายแรงที่ตรวจพบโดยบังเอิญด้วย LDCT เราเปรียบเทียบเมตาโบโลมในซีรั่มโดยรวมของกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี (HC) ก้อนเนื้อปอดชนิดไม่ร้ายแรง (BN) และมะเร็งปอดระยะที่ 1 (LA) โดยใช้การวิเคราะห์ UPLC-HRMS เราพบว่า HC และ BN มีโปรไฟล์เมตาโบลิกที่คล้ายคลึงกัน ในขณะที่ LA แสดงการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ HC และ BN เราได้ระบุเมตาโบไลต์ในซีรั่มสองชุดที่สามารถแยกแยะ LA ออกจาก HC และ BN ได้
ปัจจุบัน การระบุเนื้องอกชนิดไม่ร้ายแรงและร้ายแรงโดยใช้ LDCT นั้น ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับขนาด ความหนาแน่น รูปร่าง และอัตราการเติบโตของเนื้องอกเมื่อเวลาผ่านไป30 การศึกษาที่ผ่านมาแสดงให้เห็นว่าขนาดของเนื้องอกมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับโอกาสในการเกิดมะเร็งปอด แม้ในผู้ป่วยที่มีความเสี่ยงสูง ความเสี่ยงของการเป็นมะเร็งในเนื้องอกที่มีขนาด <6 มม. ก็ยังน้อยกว่า 1% ความเสี่ยงของการเป็นมะเร็งในเนื้องอกที่มีขนาด 6 ถึง 20 มม. อยู่ในช่วง 8% ถึง 64%30 ดังนั้น สมาคมเฟลชเนอร์จึงแนะนำให้ใช้ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 6 มม. เป็นเกณฑ์สำหรับการติดตามผลด้วย CT เป็นประจำ29 อย่างไรก็ตาม การประเมินความเสี่ยงและการจัดการเนื้องอกในปอดที่ไม่สามารถระบุได้ (IPN) ที่มีขนาดใหญ่กว่า 6 มม. ยังไม่ได้รับการดำเนินการอย่างเพียงพอ31 การจัดการโรคหัวใจพิการแต่กำเนิดในปัจจุบันมักจะอาศัยการเฝ้าระวังอย่างใกล้ชิดร่วมกับการติดตามผลด้วย CT บ่อยครั้ง
จากข้อมูลเมตาโบโลมที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว เราได้แสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกถึงการทับซ้อนกันของลักษณะเฉพาะของเมตาโบโลมระหว่างบุคคลที่มีสุขภาพดีและก้อนเนื้อที่ไม่เป็นอันตรายขนาด <6 มม. ความคล้ายคลึงทางชีวภาพนี้สอดคล้องกับผลการตรวจ CT ก่อนหน้านี้ที่พบว่าความเสี่ยงของการเกิดมะเร็งในก้อนเนื้อขนาด <6 มม. นั้นต่ำพอๆ กับในผู้ที่ไม่มีก้อนเนื้อ30 ควรสังเกตว่าผลลัพธ์ของเรายังแสดงให้เห็นว่าก้อนเนื้อที่ไม่เป็นอันตรายขนาด <6 มม. และ ≥6 มม. มีความคล้ายคลึงกันสูงในโปรไฟล์เมตาโบโลม ซึ่งบ่งชี้ว่าคำจำกัดความเชิงหน้าที่ของสาเหตุที่ไม่เป็นอันตรายนั้นสอดคล้องกันโดยไม่คำนึงถึงขนาดของก้อนเนื้อ ดังนั้น แผงเมตาโบไลต์ในซีรั่มสำหรับการวินิจฉัยสมัยใหม่อาจให้การทดสอบเพียงครั้งเดียวเป็นการทดสอบตัดออกเมื่อตรวจพบก้อนเนื้อในเบื้องต้นจากการตรวจ CT และอาจลดการติดตามผลอย่างต่อเนื่อง ในขณะเดียวกัน แผงไบโอมาร์กเกอร์เมตาโบลิกเดียวกันนี้ยังสามารถแยกแยะก้อนเนื้อร้ายขนาด ≥6 มม. ออกจากก้อนเนื้อที่ไม่เป็นอันตราย และให้การคาดการณ์ที่แม่นยำสำหรับ IPN ที่มีขนาดใกล้เคียงกันและลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่ไม่ชัดเจนในภาพ CT ตัวจำแนกการเผาผลาญในซีรั่มนี้ทำงานได้ดีในการทำนายความร้ายแรงของก้อนเนื้อที่มีขนาด ≥6 มม. โดยมีค่า AUC เท่ากับ 0.927 โดยสรุปแล้ว ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าลายเซ็นการเผาผลาญในซีรั่มที่เป็นเอกลักษณ์อาจสะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญที่เกิดจากเนื้องอกในระยะเริ่มต้นโดยเฉพาะ และมีศักยภาพในการใช้เป็นตัวทำนายความเสี่ยง โดยไม่ขึ้นอยู่กับขนาดของก้อนเนื้อ
ที่น่าสังเกตคือ มะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา (LUAD) และมะเร็งปอดชนิดสความัสเซลล์คาร์ซิโนมา (LUSC) เป็นมะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์เล็ก (NSCLC) ประเภทหลัก เนื่องจาก LUSC มีความสัมพันธ์อย่างมากกับการใช้ยาสูบ47 และ LUAD เป็นเนื้อเยื่อวิทยาที่พบบ่อยที่สุดของก้อนเนื้อในปอดที่ตรวจพบโดยบังเอิญจากการตรวจคัดกรอง CT48 ดังนั้นแบบจำลองการจำแนกของเราจึงถูกสร้างขึ้นมาโดยเฉพาะสำหรับตัวอย่างอะเดโนคาร์ซิโนมาในระยะที่ 1 Wang และคณะยังมุ่งเน้นไปที่ LUAD และระบุลายเซ็นไขมัน 9 แบบโดยใช้ลิพิโดมิกส์เพื่อแยกแยะมะเร็งปอดระยะเริ่มต้นออกจากบุคคลที่มีสุขภาพดี17 เราได้ทดสอบแบบจำลองการจำแนกในปัจจุบันกับ LUSC ระยะที่ 1 จำนวน 16 ราย และก้อนเนื้อที่ไม่เป็นมะเร็งจำนวน 74 ราย และพบว่าความแม่นยำในการทำนาย LUSC ต่ำ (AUC 0.776) ซึ่งบ่งชี้ว่า LUAD และ LUSC อาจมีลายเซ็นเมตาโบลิกของตัวเอง ที่จริงแล้ว LUAD และ LUSC ได้แสดงให้เห็นว่ามีความแตกต่างกันในด้านสาเหตุ ต้นกำเนิดทางชีววิทยา และความผิดปกติทางพันธุกรรม49 ดังนั้น จึงควรมีการรวมเนื้อเยื่อวิทยาประเภทอื่นๆ เข้าไว้ในแบบจำลองการฝึกอบรมสำหรับการตรวจหาโรคมะเร็งปอดในระดับประชากรในโครงการคัดกรอง
ในที่นี้ เราได้ระบุเส้นทางเมตาบอลิซึมที่เปลี่ยนแปลงบ่อยที่สุด 6 เส้นทางในมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดีและก้อนเนื้อที่ไม่เป็นมะเร็ง แซนทีนและไฮโปแซนทีนเป็นเมตาบอไลต์ทั่วไปของเส้นทางเมตาบอลิซึมของพิวรีน สอดคล้องกับผลลัพธ์ของเรา สารตัวกลางที่เกี่ยวข้องกับเมตาบอลิซึมของพิวรีนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในซีรั่มหรือเนื้อเยื่อของผู้ป่วยมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดีหรือผู้ป่วยในระยะก่อนลุกลาม15,50 ระดับแซนทีนและไฮโปแซนทีนในซีรั่มที่สูงขึ้นอาจสะท้อนถึงกระบวนการสร้างสารที่จำเป็นโดยเซลล์มะเร็งที่เพิ่มจำนวนอย่างรวดเร็ว การควบคุมการเผาผลาญกลูโคสที่ผิดปกติเป็นลักษณะเด่นที่รู้จักกันดีของการเผาผลาญในมะเร็ง51 ในที่นี้ เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของไพรูเวทและแลคเตทในกลุ่ม LA เมื่อเทียบกับกลุ่ม HC และ BN ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้เกี่ยวกับความผิดปกติของเส้นทางไกลโคไลซิสในโปรไฟล์เมตาโบโลมในซีรั่มของผู้ป่วยมะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์ขนาดเล็ก (NSCLC) และกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี ผลลัพธ์มีความสอดคล้อง52,53
ที่สำคัญ เราพบความสัมพันธ์ผกผันระหว่างการเผาผลาญไพรูเวทและทริปโตเฟนในซีรั่มของผู้ป่วยมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา ระดับทริปโตเฟนในซีรั่มลดลงในกลุ่ม LA เมื่อเทียบกับกลุ่ม HC หรือ BN ที่น่าสนใจคือ การศึกษาขนาดใหญ่ก่อนหน้านี้โดยใช้กลุ่มตัวอย่างแบบไปข้างหน้าพบว่าระดับทริปโตเฟนในกระแสเลือดที่ต่ำมีความสัมพันธ์กับความเสี่ยงที่เพิ่มขึ้นของมะเร็งปอด 54 ทริปโตเฟนเป็นกรดอะมิโนจำเป็นที่เราได้รับจากอาหารทั้งหมด เราสรุปได้ว่าการลดลงของทริปโตเฟนในซีรั่มของผู้ป่วยมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมาอาจสะท้อนถึงการลดลงอย่างรวดเร็วของสารเมตาบอไลต์นี้ เป็นที่ทราบกันดีว่าผลิตภัณฑ์สุดท้ายของการสลายทริปโตเฟนผ่านทางวิถีคีนูเรนีนเป็นแหล่งที่มาของการสังเคราะห์ NAD+ ใหม่ เนื่องจาก NAD+ ผลิตขึ้นเป็นหลักผ่านทางวิถีการกู้คืน ความสำคัญของ NAD+ ในการเผาผลาญทริปโตเฟนในภาวะสุขภาพและโรคยังคงต้องได้รับการพิจารณาต่อไป46 จากการวิเคราะห์ฐานข้อมูล TCGA ของเรา พบว่าการแสดงออกของตัวขนส่งทริปโตเฟน solute transporter 7A5 (SLC7A5) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมปกติ และมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการแสดงออกของเอนไซม์ไกลโคไลซิส GAPDH การศึกษาในอดีตส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่บทบาทของการสลายทริปโตเฟนในการยับยั้งการตอบสนองภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอก40,41,42 ในที่นี้ เราแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งการดูดซึมทริปโตเฟนโดยการลดระดับ SLC7A5 ในเซลล์มะเร็งปอด ส่งผลให้ระดับ NAD ในเซลล์ลดลง และกิจกรรมไกลโคไลซิสลดลงตามไปด้วย โดยสรุป การศึกษาของเราให้พื้นฐานทางชีววิทยาสำหรับการเปลี่ยนแปลงในการเผาผลาญในซีรั่มที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงไปเป็นมะเร็งของมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา
การกลายพันธุ์ของ EGFR เป็นการกลายพันธุ์ที่ก่อให้เกิดโรคได้บ่อยที่สุดในผู้ป่วย NSCLC ในการศึกษาของเรา เราพบว่าผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ของ EGFR (n = 41) มีโปรไฟล์เมตาโบลิกโดยรวมคล้ายกับผู้ป่วยที่มี EGFR ชนิดปกติ (n = 31) แม้ว่าเราจะพบระดับอะซิลคาร์นิทีนในซีรั่มที่ลดลงในผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ของ EGFR บางรายก็ตาม หน้าที่ที่ได้รับการยืนยันของอะซิลคาร์นิทีนคือการขนส่งกลุ่มอะซิลจากไซโตพลาสซึมเข้าสู่เมทริกซ์ของไมโทคอนเดรีย ซึ่งนำไปสู่การออกซิเดชันของกรดไขมันเพื่อผลิตพลังงาน 55 สอดคล้องกับผลการค้นพบของเรา การศึกษาล่าสุดยังระบุโปรไฟล์เมตาโบโลมที่คล้ายคลึงกันระหว่างเนื้องอกที่มีการกลายพันธุ์ของ EGFR และเนื้องอกที่มี EGFR ชนิดปกติ โดยการวิเคราะห์เมตาโบโลมโดยรวมของตัวอย่างเนื้อเยื่อมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา 102 ตัวอย่าง50 ที่น่าสนใจคือ พบปริมาณอะซิลคาร์นิทีนในกลุ่มที่มีการกลายพันธุ์ของ EGFR ด้วย ดังนั้น การที่การเปลี่ยนแปลงระดับอะซิลคาร์นิทีนสะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมที่เกิดจาก EGFR และกลไกทางโมเลกุลที่เกี่ยวข้องนั้น อาจเป็นเรื่องที่ควรศึกษาเพิ่มเติม
โดยสรุปแล้ว การศึกษาของเราได้สร้างตัวจำแนกการเผาผลาญในซีรั่มเพื่อใช้ในการวินิจฉัยแยกโรคของก้อนเนื้อในปอด และเสนอขั้นตอนการทำงานที่สามารถเพิ่มประสิทธิภาพการประเมินความเสี่ยงและอำนวยความสะดวกในการจัดการทางคลินิกโดยอาศัยการตรวจคัดกรองด้วย CT สแกน
การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลมะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซน โรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยซุนยัตเซน และคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลมะเร็งมหาวิทยาลัยเจิ้งโจว ในกลุ่มการค้นพบและการตรวจสอบภายใน มีการเก็บตัวอย่างซีรัมจากบุคคลที่มีสุขภาพดี 174 ตัวอย่าง และซีรัมจากก้อนเนื้อที่ไม่ร้ายแรง 244 ตัวอย่าง จากผู้ที่เข้ารับการตรวจสุขภาพประจำปีที่แผนกควบคุมและป้องกันมะเร็ง ศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซน และซีรัมจากก้อนเนื้อที่ไม่ร้ายแรง 166 ตัวอย่าง จากผู้ป่วยมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา ระยะที่ 1 จากศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซน ในกลุ่มการตรวจสอบภายนอก มีผู้ป่วยก้อนเนื้อที่ไม่ร้ายแรง 48 ราย ผู้ป่วยมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา ระยะที่ 1 39 ราย จากโรงพยาบาลในเครือแห่งแรกของมหาวิทยาลัยซุนยัตเซน และผู้ป่วยมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา ระยะที่ 1 24 ราย จากโรงพยาบาลมะเร็งเจิ้งโจว ศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซนยังได้รวบรวมกรณีมะเร็งปอดชนิดเซลล์สความัสระยะที่ 1 จำนวน 16 ราย เพื่อทดสอบความสามารถในการวินิจฉัยของตัวจำแนกเมตาบอลิซึมที่สร้างขึ้น (ลักษณะของผู้ป่วยแสดงในตารางเสริม 5) ตัวอย่างจากกลุ่มการค้นพบและกลุ่มการตรวจสอบภายในถูกรวบรวมระหว่างเดือนมกราคม 2561 ถึงพฤษภาคม 2563 ตัวอย่างสำหรับกลุ่มการตรวจสอบภายนอกถูกรวบรวมระหว่างเดือนสิงหาคม 2564 ถึงตุลาคม 2565 เพื่อลดอคติทางเพศ จึงได้กำหนดจำนวนผู้ป่วยชายและหญิงให้ใกล้เคียงกันในแต่ละกลุ่ม ทีมค้นพบและทีมตรวจสอบภายใน การกำหนดเพศของผู้เข้าร่วมขึ้นอยู่กับการรายงานตนเอง ได้รับความยินยอมจากผู้เข้าร่วมทุกคนและไม่มีการให้ค่าตอบแทนใดๆ ผู้ป่วยที่มีก้อนเนื้อที่ไม่ร้ายแรงคือผู้ที่มีคะแนนการสแกน CT ที่คงที่ในช่วง 2 ถึง 5 ปี ณ เวลาที่ทำการวิเคราะห์ ยกเว้น 1 รายจากตัวอย่างการตรวจสอบภายนอก ซึ่งถูกรวบรวมก่อนการผ่าตัดและวินิจฉัยโดยพยาธิวิทยา ยกเว้นโรคหลอดลมอักเสบเรื้อรัง กรณีมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมาได้รับการรวบรวมก่อนการผ่าตัดปอดและได้รับการยืนยันโดยการวินิจฉัยทางพยาธิวิทยา เก็บตัวอย่างเลือดขณะอดอาหารในหลอดแยกซีรั่มโดยไม่ใช้สารกันเลือดแข็งตัว ปล่อยให้เลือดแข็งตัวเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นนำไปปั่นเหวี่ยงที่ 2851 × g เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4°C เพื่อเก็บซีรั่มส่วนบน แบ่งซีรั่มเป็นส่วนๆ และแช่แข็งที่ -80°C จนกว่าจะถึงขั้นตอนการสกัดเมตาโบไลต์ ภาควิชาป้องกันมะเร็งและการตรวจสุขภาพของศูนย์มะเร็งมหาวิทยาลัยซุนยัตเซนได้รวบรวมซีรั่มรวมจากผู้บริจาคสุขภาพดี 100 คน โดยมีจำนวนชายและหญิงเท่ากัน อายุระหว่าง 40 ถึง 55 ปี นำตัวอย่างจากผู้บริจาคแต่ละคนมาผสมกันในปริมาณเท่ากัน แบ่งซีรั่มที่ได้เป็นส่วนๆ และเก็บรักษาไว้ที่ -80°C ส่วนผสมของซีรั่มนี้ใช้เป็นวัสดุอ้างอิงสำหรับการควบคุมคุณภาพและการกำหนดมาตรฐานข้อมูล
ซีรั่มอ้างอิงและตัวอย่างทดสอบถูกละลายน้ำแข็งและสกัดเมตาบอไลต์โดยใช้วิธีการสกัดแบบผสม (MTBE/เมทานอล/น้ำ) 56 โดยสังเขป ซีรั่ม 50 ไมโครลิตร ผสมกับเมทานอลเย็นจัด 225 ไมโครลิตร และเมทิลเทอร์ท-บิวทิลอีเทอร์ (MTBE) เย็นจัด 750 ไมโครลิตร คนส่วนผสมและบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นตัวอย่างถูกผสมและผสมด้วยเครื่องปั่นเหวี่ยงกับน้ำเกรด MS 188 ไมโครลิตร ที่มีสารมาตรฐานภายใน (13C-แลคเตท, 13C3-ไพรูเวต, 13C-เมไทโอนีน และ 13C6-ไอโซลิวซีน ซึ่งซื้อจาก Cambridge Isotope Laboratories) จากนั้นส่วนผสมถูกปั่นเหวี่ยงที่ 15,000 × g เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4 °C และเฟสล่างถูกถ่ายโอนไปยังหลอดสองหลอด (หลอดละ 125 ไมโครลิตร) สำหรับการวิเคราะห์ LC-MS ในโหมดบวกและลบ สุดท้าย ตัวอย่างถูกระเหยจนแห้งสนิทโดยใช้เครื่องระเหยสุญญากาศความเร็วสูง
สารเมตาบอไลต์ที่แห้งแล้วถูกละลายใหม่ในอะซีโตไนไตรล์ 80% ปริมาณ 120 ไมโครลิตร เขย่าด้วยเครื่องปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาที และปั่นเหวี่ยงที่ 15,000 × g เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C ส่วนของเหลวใสถูกถ่ายลงในขวดแก้วสีอำพันที่มีไมโครอินเสิร์ตสำหรับการศึกษาเมตาบอไลต์ การวิเคราะห์เมตาบอไลต์แบบไม่เจาะจงเป้าหมายบนแพลตฟอร์มโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง-แมสสเปกโทรเมตรีความละเอียดสูง (UPLC-HRMS) สารเมตาบอไลต์ถูกแยกโดยใช้ระบบ Dionex Ultimate 3000 UPLC และคอลัมน์ ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 มม., 1.7 ไมโครเมตร, Waters) ในโหมดไอออนบวก เฟสเคลื่อนที่คืออะซีโตไนไตรล์ 95% (A) และ 50% (B) โดยแต่ละเฟสประกอบด้วยแอมโมเนียมอะซิเตต 10 มิลลิโมล/ลิตร และกรดฟอร์มิก 0.1% ในโหมดลบ เฟสเคลื่อนที่ A และ B ประกอบด้วยอะซีโตไนไตรล์ 95% และ 50% ตามลำดับ โดยทั้งสองเฟสมีแอมโมเนียมอะซิเตต 10 มิลลิโมล/ลิตร และ pH = 9 โปรแกรมการไล่ระดับความเข้มข้นมีดังนี้: 0–0.5 นาที, 2% B; 0.5–12 นาที, 2–50% B; 12–14 นาที, 50–98% B; 14–16 นาที, 98% B; 16–16.1 นาที, 98–2% B; 16.1–20 นาที, 2% B คอลัมน์ถูกรักษาอุณหภูมิไว้ที่ 40°C และตัวอย่างที่ 10°C ในเครื่องป้อนตัวอย่างอัตโนมัติ อัตราการไหลคือ 0.3 มล./นาที และปริมาตรการฉีดคือ 3 ไมโครลิตร เครื่องแมสสเปกโทรเมตรีแบบ Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) ที่มีแหล่งกำเนิดไอออนแบบอิเล็กโทรสเปรย์ (ESI) ถูกใช้งานในโหมดสแกนเต็มรูปแบบและเชื่อมต่อกับโหมดตรวจสอบ ddMS2 เพื่อรวบรวมข้อมูลปริมาณมาก พารามิเตอร์ของ MS ถูกตั้งค่าดังนี้: แรงดันสเปรย์ +3.8 kV/- 3.2 kV, อุณหภูมิแคปิลลารี 320°C, ก๊าซป้องกัน 40 arb, ก๊าซเสริม 10 arb, อุณหภูมิฮีตเตอร์โพรบ 350°C, ช่วงการสแกน 70–1050 m/h, ความละเอียด 70,000 ข้อมูลถูกเก็บรวบรวมโดยใช้ Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific)
เพื่อประเมินคุณภาพข้อมูล ตัวอย่างควบคุมคุณภาพ (QC) แบบรวมถูกสร้างขึ้นโดยการนำสารละลายส่วนบน (supernatant) ปริมาณ 10 μL ออกจากแต่ละตัวอย่าง มีการวิเคราะห์ตัวอย่างควบคุมคุณภาพ 6 ตัวอย่างในช่วงเริ่มต้นของลำดับการวิเคราะห์เพื่อประเมินความเสถียรของระบบ UPLC-MS จากนั้นจะมีการนำตัวอย่างควบคุมคุณภาพเข้าสู่ชุดการวิเคราะห์เป็นระยะ ตัวอย่างซีรั่มทั้ง 11 ชุดในการศึกษานี้ได้รับการวิเคราะห์โดย LC-MS มีการใช้ตัวอย่างซีรั่มผสมจากผู้บริจาคสุขภาพดี 100 คนเป็นวัสดุอ้างอิงในแต่ละชุดเพื่อตรวจสอบกระบวนการสกัดและปรับแก้ผลกระทบระหว่างชุดการวิเคราะห์ การวิเคราะห์เมตาโบลิกส์แบบไม่เจาะจงเป้าหมายของกลุ่มตัวอย่างสำหรับการค้นพบ กลุ่มตัวอย่างสำหรับการตรวจสอบภายใน และกลุ่มตัวอย่างสำหรับการตรวจสอบภายนอก ดำเนินการที่ศูนย์เมตาโบลิกส์ มหาวิทยาลัยซุนยัตเซน ห้องปฏิบัติการภายนอกของศูนย์วิเคราะห์และทดสอบ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีมณฑลกวางตุ้ง ยังได้วิเคราะห์ตัวอย่าง 40 ตัวอย่างจากกลุ่มตัวอย่างภายนอกเพื่อทดสอบประสิทธิภาพของแบบจำลองการจำแนกประเภทด้วย
หลังจากสกัดและปรับสภาพแล้ว จะทำการวัดปริมาณสารเมตาบอไลต์ในซีรั่มโดยใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษร่วมกับแมสสเปกโทรเมตรีแบบแทงเดม (Agilent 6495 triple quadrupole) โดยใช้แหล่งกำเนิดไอออนไนเซชันแบบอิเล็กโทรสเปรย์ (ESI) ในโหมดการตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการ (MRM) ใช้คอลัมน์ ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 มม., 1.7 μm, Waters) ในการแยกสารเมตาบอไลต์ เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยอะซีโตไนไตรล์ 90% (A) และ 5% (B) ร่วมกับแอมโมเนียมอะซิเตต 10 มิลลิโมล/ลิตร และสารละลายแอมโมเนีย 0.1% โปรแกรมการไล่ระดับความเข้มข้นมีดังนี้: 0–1.5 นาที, 0% B; 1.5–6.5 นาที, 0–15% B; 6.5–8 นาที, 15% B; 8–8.5 นาที, 15%–0% B; 8.5–11.5 นาที, 0%B. คอลัมน์ถูกรักษาไว้ที่ 40 °C และตัวอย่างที่ 10 °C ในเครื่องป้อนตัวอย่างอัตโนมัติ อัตราการไหลอยู่ที่ 0.3 มล./นาที และปริมาตรการฉีดอยู่ที่ 1 μL พารามิเตอร์ MS ถูกตั้งค่าดังนี้: แรงดันแคปิลลารี ±3.5 kV, แรงดันเนบิวไลเซอร์ 35 psi, อัตราการไหลของก๊าซชีท 12 ลิตร/นาที, อุณหภูมิก๊าซชีท 350°C, อุณหภูมิก๊าซแห้ง 250°C และอัตราการไหลของก๊าซแห้ง 14 ลิตร/นาที ค่าการแปลง MRM ของทริปโตเฟน, ไพรูเวต, แลคเตต, ไฮโปแซนทีน และแซนทีน คือ 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 และ 151.0–107.9 ตามลำดับ ข้อมูลถูกรวบรวมโดยใช้เครื่อง Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) สำหรับตัวอย่างซีรัม ปริมาณของทริปโตเฟน ไพรูเวท แลคเตท ไฮโปแซนทีน และแซนทีน ถูกวัดโดยใช้กราฟสอบเทียบของสารละลายผสมมาตรฐาน สำหรับตัวอย่างเซลล์ ปริมาณทริปโตเฟนถูกปรับให้เป็นมาตรฐานโดยเทียบกับสารมาตรฐานภายในและมวลโปรตีนของเซลล์
การสกัดพีค (m/z และเวลาการคงตัว (RT)) ดำเนินการโดยใช้ Compound Discovery 3.1 และ TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) เพื่อขจัดความแตกต่างที่อาจเกิดขึ้นระหว่างชุดการผลิต แต่ละพีคที่มีลักษณะเฉพาะของตัวอย่างทดสอบจะถูกหารด้วยพีคที่มีลักษณะเฉพาะของวัสดุอ้างอิงจากชุดการผลิตเดียวกันเพื่อให้ได้ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ของสารมาตรฐานภายในก่อนและหลังการปรับมาตรฐานแสดงอยู่ในตารางเสริม 6 ความแตกต่างระหว่างสองกลุ่มมีลักษณะเฉพาะโดยอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR<0.05, การทดสอบ Wilcoxon signed rank) และการเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัว (>1.2 หรือ <0.83) ข้อมูล MS ดิบของคุณลักษณะที่สกัดได้และข้อมูล MS ที่แก้ไขซีรั่มอ้างอิงแสดงอยู่ในข้อมูลเสริม 1 และข้อมูลเสริม 2 ตามลำดับ การระบุพีคดำเนินการโดยอิงตามระดับการระบุสี่ระดับที่กำหนดไว้ ได้แก่ เมตาโบไลต์ที่ระบุ สารประกอบที่คาดว่าจะระบุ สารประกอบที่คาดว่าจะมีลักษณะเฉพาะ และสารประกอบที่ไม่รู้จัก 22 จากการค้นหาฐานข้อมูลใน Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) สารประกอบทางชีวภาพที่มี MS/MS ตรงกับมาตรฐานที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว หรือมีการระบุตรงกันอย่างแม่นยำใน mzCloud (คะแนน > 85) หรือ Chemspider จะถูกเลือกเป็นตัวกลางระหว่างเมตาโบโลมที่แตกต่างกัน การระบุพีคสำหรับแต่ละคุณลักษณะรวมอยู่ในข้อมูลเสริม 3 MetaboAnalyst 5.0 ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์แบบตัวแปรเดียวของปริมาณเมตาโบไลต์ที่ปรับค่าผลรวมให้เป็นมาตรฐาน MetaboAnalyst 5.0 ยังประเมินการวิเคราะห์การเสริมคุณค่าของวิถี KEGG โดยอิงจากเมตาโบไลต์ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) และการวิเคราะห์จำแนกความแตกต่างแบบกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน (PLS-DA) ถูกวิเคราะห์โดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ ropls (v.1.26.4) พร้อมการปรับค่าสแต็กให้เป็นมาตรฐานและการปรับขนาดอัตโนมัติ แบบจำลองไบโอมาร์กเกอร์เมตาโบไลต์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำนายความร้ายแรงของก้อนเนื้อถูกสร้างขึ้นโดยใช้การถดถอยโลจิสติกแบบไบนารีด้วยตัวดำเนินการลดขนาดและเลือกค่าสัมบูรณ์น้อยที่สุด (LASSO, แพ็กเกจ R เวอร์ชัน 4.1-3) ประสิทธิภาพของแบบจำลองการจำแนกในชุดการตรวจจับและการตรวจสอบถูกกำหนดลักษณะโดยการประมาณค่า AUC โดยอิงจากการวิเคราะห์ ROC ตามแพ็กเกจ pROC (เวอร์ชัน 1.18.0) ค่าตัดความน่าจะเป็นที่เหมาะสมที่สุดได้มาจากค่าดัชนี Youden สูงสุดของแบบจำลอง (ความไว + ความจำเพาะ – 1) ตัวอย่างที่มีค่าน้อยกว่าหรือมากกว่าค่าเกณฑ์จะถูกทำนายว่าเป็นก้อนเนื้อที่ไม่ร้ายแรงและมะเร็งปอดชนิดอะเดโนคาร์ซิโนมา ตามลำดับ
เซลล์ A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) ถูกเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ F-12K ที่มี FBS 10% ลำดับ short hairpin RNA (shRNA) ที่กำหนดเป้าหมาย SLC7A5 และตัวควบคุมที่ไม่กำหนดเป้าหมาย (NC) ถูกแทรกเข้าไปในเวกเตอร์ไวรัสเลนติ pLKO.1-puro ลำดับแอนติเซนส์ของ shSLC7A5 มีดังนี้: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′) แอนติบอดีต่อ SLC7A5 (#5347) และทูบูลิน (#2148) ถูกซื้อจาก Cell Signaling Technology แอนติบอดีต่อ SLC7A5 และทูบูลินถูกใช้ในอัตราส่วนเจือจาง 1:1000 สำหรับการวิเคราะห์ Western blot
ชุดทดสอบ Seahorse XF Glycolytic Stress Test วัดระดับความเป็นกรดนอกเซลล์ (ECAR) ในการทดสอบนี้ จะมีการให้กลูโคส โอลิโกไมซิน เอ และ 2-DG ตามลำดับ เพื่อทดสอบความสามารถในการสลายกลูโคสของเซลล์ ซึ่งวัดได้จากระดับ ECAR
เซลล์ A549 ที่ได้รับการถ่ายยีนด้วยตัวควบคุมที่ไม่จำเพาะเป้าหมาย (NC) และ shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ถูกเพาะเลี้ยงข้ามคืนในจานเพาะเลี้ยงขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 10 ซม. สารเมตาบอไลต์ของเซลล์ถูกสกัดด้วยเมทานอลในน้ำ 80% ที่เย็นจัด 1 มล. เซลล์ในสารละลายเมทานอลถูกขูดออก รวบรวมลงในหลอดใหม่ และปั่นเหวี่ยงที่ 15,000 × g เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4°C เก็บสารละลายส่วนบน 800 µl และทำให้แห้งโดยใช้เครื่องระเหยสุญญากาศความเร็วสูง จากนั้นนำตะกอนเมตาบอไลต์ที่แห้งแล้วไปวิเคราะห์ระดับทริปโตเฟนโดยใช้ LC-MS/MS ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ระดับ NAD(H) ในเซลล์ A549 (NC และ shSLC7A5) ถูกวัดโดยใช้ชุดตรวจวัด NAD+/NADH แบบสีเชิงปริมาณ (#K337, BioVision) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต มีการวัดระดับโปรตีนในแต่ละตัวอย่างเพื่อปรับปริมาณสารเมตาบอไลต์ให้เป็นมาตรฐาน
ไม่ได้ใช้วิธีการทางสถิติใดๆ ในการกำหนดขนาดตัวอย่างเบื้องต้น งานวิจัยด้านเมตาโบโลมิกส์ก่อนหน้านี้ที่มุ่งเน้นการค้นหาไบโอมาร์กเกอร์15,18 ถือเป็นเกณฑ์มาตรฐานสำหรับการกำหนดขนาด และเมื่อเปรียบเทียบกับรายงานเหล่านี้ ตัวอย่างของเราถือว่าเพียงพอแล้ว ไม่มีตัวอย่างใดถูกตัดออกจากกลุ่มตัวอย่างในการศึกษา ตัวอย่างซีรั่มถูกสุ่มจัดสรรให้กับกลุ่มค้นหา (306 กรณี คิดเป็น 74.6%) และกลุ่มตรวจสอบความถูกต้องภายใน (104 กรณี คิดเป็น 25.4%) สำหรับการศึกษาเมตาโบโลมิกส์แบบไม่เจาะจงเป้าหมาย นอกจากนี้ เรายังสุ่มเลือก 70 กรณีจากแต่ละกลุ่มจากชุดค้นหาสำหรับการศึกษาเมตาโบโลมิกส์แบบเจาะจงเป้าหมาย นักวิจัยไม่ทราบถึงการจัดกลุ่มในระหว่างการเก็บรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูล LC-MS การวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูลเมตาโบโลมิกส์และการทดลองในเซลล์ได้อธิบายไว้ในส่วนผลลัพธ์ คำอธิบายภาพ และวิธีการตามลำดับ การหาปริมาณทริปโตเฟน NADT และกิจกรรมไกลโคไลซิสในเซลล์ดำเนินการสามครั้งอย่างอิสระโดยได้ผลลัพธ์ที่เหมือนกัน
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการศึกษา โปรดดูบทคัดย่อรายงาน Natural Portfolio ที่แนบมากับบทความนี้
ข้อมูล MS ดิบของคุณลักษณะที่สกัดได้และข้อมูล MS ที่ปรับให้เป็นมาตรฐานของซีรั่มอ้างอิงแสดงอยู่ในข้อมูลเสริม 1 และข้อมูลเสริม 2 ตามลำดับ คำอธิบายจุดสูงสุดสำหรับคุณลักษณะที่แตกต่างกันแสดงอยู่ในข้อมูลเสริม 3 ชุดข้อมูล LUAD TCGA สามารถดาวน์โหลดได้จาก https://portal.gdc.cancer.gov/ ข้อมูลป้อนเข้าสำหรับการสร้างกราฟมีให้ในข้อมูลต้นฉบับ ข้อมูลต้นฉบับมีให้สำหรับบทความนี้
กลุ่มศึกษาคัดกรองมะเร็งปอดแห่งชาติ ฯลฯ การลดอัตราการเสียชีวิตจากมะเร็งปอดด้วยการตรวจเอกซเรย์คอมพิวเตอร์แบบใช้ปริมาณรังสีต่ำ วารสารการแพทย์ภาคเหนือของอังกฤษ 365, 395–409 (2011)
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR และ Prophet, PC การตรวจคัดกรองมะเร็งปอดโดยใช้ CT แบบเกลียวปริมาณต่ำ: ผลลัพธ์จากการศึกษาการตรวจคัดกรองมะเร็งปอดแห่งชาติ (NLST) J. Med. Screen 18, 109–111 (2011)
De Koning, HJ และคณะ การลดอัตราการเสียชีวิตจากมะเร็งปอดด้วยการตรวจคัดกรองด้วย CT แบบสามมิติในการทดลองแบบสุ่ม Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020)
วันที่โพสต์: 18 กันยายน 2023